轉基因大豆mon87769的lamp檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【專利說明】 轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方
法
技術領域
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，涉及轉基因植物及其產品的檢測方法，具體涉及一種利用環介導等溫擴增技術(LAMP)快速檢測轉基因大豆M0N87769的引物組、試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002]2014年全球轉基因作物種植面積高達1.815億公頃，比1996年商業化初期增長了100余倍。目前商業化種植的轉基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，其中全球種植面積最大的為轉基因大豆，2014年達到9070萬公頃，占全球轉基因作物總面積的50%。轉基因大豆M0N87769是美國孟山都公司研發的一種品質改良轉基因大豆新品種，已在我國申請進口用作加工原料。針對轉基因大豆M0N87769開展快速精準的檢測方法研究，是轉基因生物安全管理相關法律法規順利實施的技術支撐和保障。
[0003]轉基因成分檢測技術主要分為兩大類:一類以外源DNA為檢測對象，如PCR、基因芯片等，另一類以外源基因表達的蛋白質為檢測對象，如ELISA、免疫試紙條等。在上述方法中，目前PCR技術應用最為廣泛，但基于PCR的轉基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統等專業儀器設備，且擴增和產物檢測時間較長(約3~4 h)，難以達到現場快速檢測目的，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準確、且適用于現場操作的轉基因檢測新技術。
[0004]LAMP技術是由日本榮研化學株式會社在2000年開發的一種新的基因擴增技術，該技術的基本特點是:①恒溫擴增:整個擴增反應在恒溫條件(60~65°C)進行，不需要特殊儀器設備；②快速高效:整個擴增和產物檢測可在I h內完成；③高特異性:針對靶標序列的6個區域設計4條檢測引物，擴增特異性高；④高靈敏度:檢測極限可低至10個拷貝或更低；⑤鑒定簡便:可通過肉眼或濁度儀觀察反應管內的沉淀變化，或在反應管中加入染色劑后通過肉眼觀察顏色變化等方法，對擴增產物進行便捷的檢測。
[0005]LAMP方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高等特點，不需要特殊儀器，適合現場快速檢測，在轉基因植物檢測領域具有廣闊的應用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測轉基因大豆M0N87769的檢測方法和試劑盒。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的在于公開一種轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測引物組。
[0007]本發明的另一個目的在于公開一種轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測試劑盒。
[0008]本發明的另一個目的在于公開一種基于上述引物組和試劑盒檢測轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測方法。
[0009]本發明所采用的技術方案如下:
根據轉基因大豆M0N87769的轉化體特異性的核苷酸序列，設計轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-6 ;確定LAMP檢測方法的技術參數，并對檢測方法的特異性進行驗證。
[0010]轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測引物組，包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 F3:GTAGATTTCCCGGACATGAA (SEQ ID NO:I)；
外引物 B3:TCTTGACATTCTTCAAACAATCA (SEQ ID NO:2)；
內引物 FIP:TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA (SEQ ID NO:
3)；
內引物 BIP:TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG (SEQ ID NO:
4)；
環引物 LF:TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT (SEQ ID NO:5);
環引物 LB:AATGGGCCATGAAGATGGTTT (SEQ ID NO:6)。
[0011]轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測引物溶液:由上述6條引物配制的檢測引物溶液，外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB的濃度依次為4~6 Mmol/L,4-6 Mmol/L,32-48Mmol/L、32~48 Mmol/L、4~6 Mmol/L和 4~6 Mmol/L ；
(2)具有鏈置換活性的DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ;
(3)1X 反應緩沖液:200 mmol/L Tris-HCU pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜堿；
(4)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP, dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(5)顯色齊IJ:1000XSYBR GREEN I 熒光染料。
[0012]優選的，所述的檢測引物溶液中含有5 Mmol/L外引物F3、5 Mmol/L外引物B3、40Mmol/L 內引物 FIP、40 Mmol/L 內引物 BIP、5 Mmol/L 環引物 LF、5 Mmol/L 環引物 LB。
[0013]優選的，所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/μ L0
[0014]優選的，所述的10Χ反應緩沖液中MgSO4、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0015]利用以上所述的試劑盒檢測轉基因大豆M0N87769的方法，包括如下步驟:
(1)提取待測樣品的基因組DNA；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應體系:在200μ L PCR反應管內加入模板DNA 2-5yL、檢測引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10 X反應緩沖液2.5 μ UdNTPs溶液2~5μ L，用滅菌去離子水或超純水補齊至總體積為25 μ L ;
(3)運行LAMP擴增反應:63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min終止反應；
(4)LAMP擴增結果的鑒定:在反應管中加入1~2μ L顯色劑，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果。
[0016]通過實驗證明，本發明提供的轉基因大豆Μ0Ν87769的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強等優點。
【附圖說明】
[0017]圖1是實施例2中進行特異性檢測的結果圖，1-17依次為轉基因大豆M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769、非轉基因大豆對照、轉基因大豆混合樣品SI (含有M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769)、轉基因大豆混合樣品 S2 (含有 M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769)、轉基因大豆混合樣品 S3 (含有 M0N87701、M0N87705)、轉基因大豆混合樣品S4 (含有M0N87708、M0N87769)、轉基因大豆混合樣品S5 (含有M0N89788、40-3-2、A5547、A2704、305423、356043、CV127)、轉基因玉米混合樣品 S6 (含有 Btll、Btl76、M0N810、MON863、NK603、GA21、TCl507、T25 )、轉基因水稻混合樣品 S7 (含有 KF-6、TT51-1)、轉基因棉花混合樣品S8 (含有MON531、MON15985、GHB614)、轉基因油菜混合樣品S9 (含有MSU RFU T45、Oxy235)、非轉基因大豆對照S10、非轉基因作物對照Sll (含有非轉基因玉米、水稻、棉花、油菜)、空白對照。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0019]實施例1試劑盒及其檢測方法。
[0020]按下列配方制備轉基因大豆M0N87769的LAMP檢測試劑盒，每個試劑盒的規格為100次反應:
(1)檢測引物溶液:合成外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB，將引物干粉用滅菌去離子水或超純水分別配成濃度為100 μ mol/L的母液，然后分別取5 “1^外引物卩3、5 4 1^外引物83、40 “1^內引物卩1?、40 4 1^內引物81卩、5 yL環引物LF、5 yL環引物LB，放入一個新的1.5 mL離心管中，充分混勻，配成100 μ L的LAMP檢測弓I物溶液，其中引物序列分別為:
外引物 F3:GTAGATTTCCCGGACATGAA (SEQ ID NO:I)；
外引物 B3:TCTTGACATTCTTCAAACAATCA (SEQ ID NO:2)；
內引物 FIP:TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA (SEQ ID NO:
3)；
內引物