一種肺癌檢測試劑盒及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種以血清中miR-21、miR-205為標志物的 肺癌檢測試劑盒，用于肺癌的篩查和術后的監測。
【背景技術】
[0002] 肺癌是一種全球范圍內都很常見的癌癥，由于臨床表現已經是晚期，故有很高的 致死率（Jemal et al，2010;Duffy et al，2007)。約有75%的肺癌患者在確診時已經是晚 期或是癌細胞已經轉移，因此肺癌患者的5年生存率不到15% (Aberle et al，2011)。一 些用于降低肺癌死亡率的篩查策略也被應用，如相對于胸透來說，重度吸煙者做LDCT篩查 可使死亡率降低20%，但是很高的假陽性和高昂的成本使得LDCT不能成為一種好的篩查 方法，我們仍然需要尋找別的篩查方法。
[0003] 近年來，血清/血衆中microRNAs (miRNAs)成為新的研究熱點。miRNA在血清/ 血漿中可以穩定存在，表達量不受各種保存條件、保存時間的影響；血清/血漿miRNA的 表達無年齡、性別的差異，且具有腫瘤特異性（Chen et al，2008)。因此，血清/血漿中 microRNAs可能成為一種新的理想的非侵入性腫瘤標志物。
[0004] 作為肺癌有前景腫瘤分子標志物，血清miRNA的檢測可對肺癌進行早期篩查診斷 和預后輔助診斷，但肺癌有關特異性miRNA表達譜的篩選、檢測方法及檢測程序的標準化、 穩定內參基因的選擇都是迫切需要解決的問題。血清中的miRNA含量遠低于組織，需要一 種非常靈敏且特異的檢測方法；又由于miRNA引物序列短，引物設計比較困難，沒有針對性 的軟件可以直接利用，故引物及體系均需篩選及優化過程。目前對miRNA的高通量篩查一 般采用芯片技術，成本高、特異性和靈敏度有限，且不能滿足零散標本實時檢測需求；對少 數miRNA的實時檢測多采用Taqman探針法，部分已形成商業化試劑盒產品，但成本和售價 尚昂。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術中的缺陷，本發明的目的在于提供miR-21與miR-205聯合作為 肺癌生物標志物在制備或篩選肺癌診斷試劑中的用途。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種肺癌診斷試劑盒。
[0007] 本發明的另一目的在于提供一種診斷肺癌的方法。
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明的第一方面，提供了 miR-21與miR-205聯合作為肺癌生物標志物在制備或 篩選肺癌診斷試劑中的用途。
[0010] 較優的，所述miR-21與miR-205聯合作為肺癌血清生物標志物。
[0011] 較優的，所述肺癌診斷試劑用于肺癌的判斷、治療方案的選擇、和/或預后評估。
[0012] 較優的，所述肺癌為非小細胞肺癌。
[0013] 將miR-21與miR-205聯合作為肺癌生物標志物用于制備肺癌診斷試劑，是指將 miR-21與miR-205聯合作為基于檢測miR-21與miR-205含量的肺癌診斷試劑的標準品或 陽性對照，用于樣本血清中的miR-21與miR-205的檢測。
[0014] 將miR-21與miR-205聯合作為肺癌生物標志物用于篩選肺癌診斷試劑，是指將 miR-21與miR-205作為靶標應用于肺癌診斷試劑的篩選。在另一優選例中，基于所述的 miR-21與miR-205基因序列，篩選特異性針對miR-21的反轉錄引物、PCR擴增引物對、探針 與特異性針對miR-205的反轉錄引物、PCR擴增引物對、探針從而作為檢測肺癌的試劑，來 檢測樣本血清中的miR-21與miR-205水平。
[0015] 本發明的第二方面，提供一種肺癌診斷試劑盒，包括特異性針對miR-21的反轉錄 引物、PCR擴增引物對、探針與特異性針對miR-205的反轉錄引物、PCR擴增引物對、探針。
[0016] 優選地，所述肺癌診斷試劑盒用于肺癌的判斷、治療方案的選擇、和/或預后評 估。
[0017] 優選地，所述肺癌為非小細胞肺癌。
[0018] 在另一優選例中，特異性針對miR-21的反轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5 所示。特異性針對miR-21的PCR擴增引物對包括針對miR-21的正向引物和反向通用引物， 針對miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示，反向通用引物的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 3所示。特異性針對miR-21的探針的核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示。特異 性針對miR-205的反轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。特異性針對miR-205的 PCR擴增引物對包括針對包括針對miR-205的正向引物和反向通用引物，針對miR-205的正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所 示。特異性針對miR-205的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0019] 在另一優選例中，所述肺癌診斷試劑盒還包括針對cel-miR-39的反轉錄引物、 PCR擴增引物對、探針。特異性針對cel-miR-39的反轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 8 所示。特異性針對cel-miR-39的PCR擴增引物對包括針對cel-miR-39的正向引物和反向 通用引物，針cel-miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示，反向通用引物的 核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。特異性針對cel-miR-39的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0020] 在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括PCR技術常用的試劑，所述PCR技術常用 的試劑包括miRNA提取試劑、逆轉錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl 2、DEPC水和Taq酶中的一種或 多種。
[0021] 在另一優選例中，所述試劑盒還包括陽性對照、陰性對照。所述陽性對照包括 miR-21、miR-205 和 cel-miR-39。所述陰性對照包括 ddH20。
[0022] 在本發明的第四方面，提供了一種診斷肺癌的方法，包括檢測樣本血清中miR-21 和miR-205的水平。
[0023] 較優的，所述肺癌為非小細胞肺癌。
[0024] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
[0025] (1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標志物，區別于傳統生物標志物，不僅穩 定、微創、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA 生物標志物的成功開發將為肺癌的早期發現和早期診斷開創全新局面，為其他疾病生物標 志物的研制提供借鑒。
[0026] (2)本發明選取了血清/血衆miR-21、miR-205聯合作為肺癌標志物，通過 qRT-PCR方法開發一種檢測快速方便、準確率高，可以實現肺癌早期篩查及預后輔助診斷的 肺癌診斷試劑盒。所述試劑盒檢測快速方便、檢測靈敏度、特異度高、成本低，可以滿足絕大 多數腫瘤病人的早期篩查及預后判斷檢測需求，應用范圍極廣，經臨床驗證預測準確率高。 所述試劑盒區分肺癌樣本和正常人樣本的檢測靈敏度為96. 3%，特異性為89. 7%。
[0027] (3)血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統全面的診斷和監測試劑盒，可用于肺癌 患者的預后判斷，療效評價及對病情發展的動態監測，有助于了解非小細胞肺癌患者疾病 進展情況，反映患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病情，及時采取更具個性化 的防治方案提供支持。
【附圖說明】
[0028] 圖1:健康人血漿樣本168-171檢測結果，miR-21、miR-205以及內參cel-miR-39 均有良好的擴增。
[0029] 圖2:健康人血漿樣本172-182,，184-197檢測結果，miR-21、miR-205以及內參 cel-miR-39均有良好的擴增。
[0030] 圖3:肺癌術前血漿樣本1P-11P檢測結果，miR-21、miR-205以及內參cel-miR-39 均有良好的擴增。
[0031] 圖4:肺癌術前血漿樣本12P-27P檢測結果，miR-21、miR-205以及內參 cel-miR-39均有良好的擴增。
[0032] 圖5 :肺癌術后血漿樣本1P-21P檢測結果，miR-21、miR-205以及內參cel-miR-39 均有良好的擴增。
[0033] 圖6:肺癌術后血漿樣本22P-26P檢測結果，miR-21、miR-205以及內參 cel-miR-39均有良好的擴增。
[0034] 圖7 :miR-21在術前與術后的表達差異。
[0035] 圖8 :miR-205在術前與術后的表達差異。
[0036] 圖 9 :-AmiR-21、-AmiR-205R0