可用于檢測與2型糖尿病相關的ptpn1基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種輔助診斷2型糖尿病的檢測試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測 與2型糖尿病相關的/77W7基因啟動子區甲基化程度的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 糖尿病（diabetes mellitus)是一種慢性代謝性疾病，是血中胰島素絕對或相 對不足，導致血糖過高，出現糖尿，進而引起脂肪和蛋白質代謝紊亂，臨床上可出現多尿、煩 渴、多飲、多食，消瘦等表現，重者容易發生酮癥酸中毒等急性并發癥或血管、神經等慢性并 發癥。糖尿病是一種常見的內分泌代謝性疾病，其患病率隨著生活條件的改善生活水平提 高都呈逐漸增長的趨勢。據統計，目前中國糖尿病患病人數接近一億，患病率高達9. 7%。糖 尿病不是單一疾病，是由遺傳及環境因素在內的多種因素共同作用的結果。其中2型糖尿 病發病人數約占糖尿病總發病人數的97%。截至目前盡管能從遺傳的角度證實不同基因的 表達能引起個體對2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM )的易感性不同，相關 候選基因的單核苷酸多態性與T2DM的發生也具有關聯性，然而遺傳因素和環境因素等病 因對T2DM發病機制仍未被完全闡釋清楚，這無疑妨礙了 T2D預防及治療水平的提高。
[0003] 蛋白酪氨酸磷酸酶 Nl( protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，尸77?￥/)基因位于人類染色體20ql3. 1能夠編碼蛋白酪氨酸磷酸酶1B( protein tyrosine phosphataselB，PTPlB)。PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases， PTPs)家族中的一員，廣泛存在于人腎臟、脾、肌肉、心、肝、腦等組織的細胞質內質網表面。 國內外已有大量研究表明在PTP1B主要是通對胰島素受體激酶或其活性片段和胰島素受 體底物-1、瘦素信號通路JAK2/STAT3、糖酵解途徑的丙酮酸激酶等磷酸化酪氨酸殘基去磷 酸化作用，從而參與胰島素、瘦素、能量代謝等信號傳導通路的負調控。經研究發現，PTP1B 與T2DM和肥胖的發生、發展有密切關系，被認為是治療T2DM和肥胖癥的一個重要潛在靶 點。也有研究報道了尸77^7基因單核苷酸多態性與T2DM發病的關系在不同人群、不同位點 的基因突變意義不同，且研究多集中于Pr〇387L、C981T和1484insG等多態位點。目前，國 內外還沒有公開任何關于檢測2型糖尿病相關/77W7基因啟動子區甲基化程度的試劑盒相 關研究報道。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種可用于檢測與2型糖尿病相關的/77W7基 因甲基化程度的試劑盒及其應用，其中尸77^/基因甲基化水平與女性人群2型糖尿病患病 率呈正相關，檢測效率高，針對性強。
[0005] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種可用于檢測與2型糖尿病相 關的/77W7基因啟動子區甲基化程度的試劑盒，該試劑盒包括/77W7基因啟動子區的甲基 化特異性擴增上游引物及其甲基化特異性擴增下游引物和甲基化特異性測序引物，其中 所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' _ TAGGGGTAGGGGATTGTA -3'， 所述的甲基化特異性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' - Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3'， 所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID NO. 3所示： 5' - TTTTCCATCTCCATAA -3'。
[0006] 上述可用于檢測與2型糖尿病相關的/77W7基因啟動子區甲基化程度的試劑盒的 應用，該試劑盒可用于2型糖尿病輔助檢測、診斷或藥物治療中。
[0007] 上述可用于檢測與2型糖尿病相關的/77W7基因啟動子區甲基化程度的試劑盒的 應用，該試劑盒可用于女性人群2型糖尿病輔助檢測、診斷或藥物治療中。
[0008] 與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明首次公開了可用于檢測與2型糖 尿病相關的尸77^/基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用，該檢測試劑盒包含一對 /77W7基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，/77W7基因啟 動子區高甲基化水平導致尸77^/基因的低表達，參與胰島素、瘦素、能量代謝等信號傳導通 路的調控，從而影響2型糖尿病的發生和發展。因此，/77W7基因啟動子區甲基化水平與2 型糖尿病的患病率呈正相關，通過檢測尸77^/基因啟動子區甲基化程度輔助診斷糖尿病， 簡單、方便，檢測效率高，針對性強，具有準確可靠、靈活快速和經濟節約的優點，有利于的 糖尿病的早期預防、早發現和及時治療。
[0009] 綜上所述，以/77W7基因啟動子區域甲基化水平為基礎的診斷試劑盒可以方便快 捷地在分子水平上實現對2型糖尿病的檢測，同時，以/77W7基因啟動子區域DNA甲基化為 靶點的藥物有望成為2型糖尿病輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
【附圖說明】
[0010] 圖1為/77W7基因被檢測序列所在區域(具體位置為Chr20:49126957-49127083) 及所檢測的8個CpG點的相關性不意圖； 圖2為/77W7基因甲基化水平檢測結果示意圖（圖中所示百分數為對應CpG位點的甲 基化程度，如圖示有CpGl到CpG8的甲基化程度分別為4%，3%，4%，10%，5%，4%，5%，5%)。
【具體實施方式】
[0011] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。 具體實施例
[0012] 1、研究對象的收集 從深圳市某慢性病研究所收集2型糖尿病患者標本，2型糖尿病診斷標準依據2010年 美國糖尿病協會(ADA)指南，排除高血壓、冠心病等心臟疾病、腎功能不全、藥物濫用、肥胖 或其他嚴重的疾病等疾病后，最后確定T2D97例作為病例組（59. 79±9. 39歲），同時收集年 齡、性別、BMI相匹配且無其他疾病的97名正常者作為對照組（59. 79±9. 39歲）。對所有研 究對象在知情同意的前提下，抽血測總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素和肌酐等一 般生化指標，同時抽取靜脈血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低溫儲存，以備用于標本統一提 取基因組DNA。
[0013] 2、基因組DNA的提取 應用Lab-Aid 820全自動核酸提取儀（中國廈門，致善生物科技）提取上述步驟得到 的樣本的全血基因組DNA，再通過NanoDrop2000超微量分光光度計（美國，Thermo Fisher Scientific)檢測所得DNA的濃度，以供如7基因和/77W7基因啟動子區DNA甲基化水平 的檢測。
[0014] 3、DNA甲基化水平測定 本研究采用焦磷酸測序技術對基因啟動子區8個CpG位點(如圖1所示)進行了DNA甲基化水平分析。此技術的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應用聚合酶鏈 反應（PCR)擴增，可使發生甲基化的胞嘧啶（C)堿基保持不變，而使未發生甲基化的C轉變 成了尿嘧啶（U)，然后通過測序引物進行PCR測序，從而得到哪個位點發生了甲基化。本次 研究采用PyroMark Assay Design軟件進行引物設計， 用于實驗的尸77^/基因啟動子區甲基化擴增引物和測序引物如下： (1) 甲基化特異性上游引物（Forward primer) 5' - TAGGGGTAGGGGATTGTA -3' （SEQ ID N0.4)， (2) 甲基化特異性下游引