一種用于血液直接熒光pcr擴增的反應液及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，尤其涉及一種用于血液直接熒光PCR擴增的反應 液及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著生物、醫學、法醫學等各相關領域的發展，熒光PCR技術得到了越來 越廣泛的應用。特別是對于血液遺傳病，感染性病毒及疾病和遺傳背景分析，熒光PCR技術 已經成為不可或缺的基本技術。而血液作為一種重要的生物分析樣本，其內含有大量的 DNA聚合酶抑制物質，如血紅素、雜蛋白、脂肪等。因此，基于現有技術，無法實現熒光PCR方 法直接對血液中的核酸進行擴增。通常，為了完成血液樣本核酸的熒光PCR擴增，必須先從 血液中對核酸物質進行純化處理。目前血液基因組提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、柱 提取法和磁珠法。盡管具體的提取方式不一樣，但是都包括以下三個過程：一是破裂細胞膜 和核膜；二是純化核酸即去除蛋白質等影響后續PCR反應的雜質；三是洗脫核酸。通過提取 處理雖然可以獲得純度比較高的核酸，但是核酸提取過程往往會導致80-90%以上的核酸 損失，同時繁瑣的提純步驟增加了樣本間交叉污染的風險，從而增加了后續熒光PCR擴增 失敗的可能。此外，由于提取過程耗時長，成本高，且需借助苯酚等有害試劑，增加了操作者 感染的風險，且難以實現高通量檢測。因此，血液樣本能夠直接作為模板或經過簡單處理就 能夠作為模板進行熒光PCR擴增檢測，成為血液熒光PCR擴增亟待解決的難題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種擴增效率高、成本低的用于血液直接熒光PCR擴增的 反應液，旨在解決現有技術對血液進行PCR擴增時，需要預先對血液進行核酸提取純化處 理，從而導致核酸大量損失、且增加了交叉污染以及有毒試劑使用的問題。
[0004] 本發明的另一目的在于提供一種血液直接熒光PCR試劑盒。
[0005] 本發明是這樣實現的，一種用于血液直接熒光PCR擴增的反應液，所述PCR反應液 中含有下列組分：寡肽、Bri j-58、Tween 20、甲酰胺。
[0006] 以及，一種血液直接熒光PCR試劑盒，包括上述用于血液直接熒光PCR擴增的反應 液。
[0007] 本發明實施例提供的用于血液直接熒光PCR擴增的反應液，通過對PCR反應液中 進行合理配制，添加了特異的協同組分，使血液中的血紅素、蛋白質和脂肪等DNA聚合酶抑 制物變性，以降低其對后續熒光PCR的抑制作用；同時，促進DNA聚合酶活性，使得熒光PCR 擴增能直接以血液為模版、在抗血液抑制作用的突變型DNA聚合酶的作用下進行高效和特 異的熒光PCR擴增。所述用于血液直接熒光PCR擴增的反應液的使用，省去了對血液樣本 進行熒光PCR擴增時進行核酸提取純化的步驟，避免了核酸的損失，顯著提高了熒光PCR擴 增的效率和成功率；同時，避免了核酸提取純化中交叉污染的可能和有毒試劑的使用，復合 環保理念。
【附圖說明】
[0008] 圖1是本發明提供的1份人血液樣本在不同寡肽濃度的PCR反應液的擴增熒光擴 增曲線圖；
[0009] 圖2是本發明提供的1份人血液樣本在不同dNTP濃度的PCR反應液的擴增熒光 擴增曲線圖；
[0010] 圖3是本發明提供的1份人血液樣本在不同Brij-58濃度的PCR反應液的擴增熒 光擴增曲線圖；
[0011] 圖4是本發明提供的1份人血液樣本在不同Tween 20濃度的PCR反應液的擴增 熒光擴增曲線圖；
[0012] 圖5是本發明提供的1份人血液樣本在不同甲酰胺濃度的PCR反應液的擴增熒光 擴增曲線圖；
[0013] 圖6是本發明實施例1提供的10份不同來源的人血液樣本的進行平行PCR的擴 增熒光擴增曲線圖；
[0014] 圖7是本發明實施例1提供的第1份人血液樣本進行三次平行實驗的熒光擴增曲 線圖；
[0015] 圖8是本發明實施例1提供的第2份人血液樣本進行三次平行實驗的熒光擴增曲 線圖；
[0016] 圖9是本發明實施例1提供的第3份人血液樣本進行三次平行實驗的熒光擴增曲 線圖；
[0017] 圖10是本發明實施例2和對比例1分別提供的PCR反應液對10份不同來源的血 液樣本進行平行PCR擴增的熒光擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用 以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0019] 為了攻克血液熒光PCR擴增時需對血液樣本進行核酸提取、以及血液內含物嚴重 抑制DNA聚合酶活性的血液抑制物問題，發明人意在開發一種避開核酸提取步驟、直接用 血液樣本進行熒光PCR擴增的方法-即以全血作為模板直接擴增目的基因的血液直接熒光 PCR擴增法。該方法主要依賴于選擇合適的PCR反應液來實現，具體的，如何研發一種針對 血液抑制物及增強DNA聚合酶酶活性的PCR反應液成為了本課題亟待解決的問題。本發明 實施例發明人立足于使血液中的血紅素、蛋白質和脂肪等物質變性，同時又能促進DNA聚 合酶活性、且對PCR擴增效率無影響、對操作者安全，通過反復的分析研究、經過多次試驗， 研究出了本發明實施例用于血液直接熒光PCR擴增的反應液。
[0020] 本發明實施例提供了一種用于血液直接熒光PCR擴增的反應液，所述PCR反應液 中含有下列組分：寡肽、Bri j-58、TWeen 20、甲酰胺。其中，所述寡肽能結合DNA聚合酶，在 PCR反應中起保護作用，使所述DNA聚合酶的酶活性不下降；所述Bri j-58和所述Tween 20 都是非離子去污劑，兩者共同使用能夠增加血液細胞的通透性，通過使蛋白質變性，破壞膜 結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中；所述甲酰胺也能分 離蛋白質-DNA復合物并使蛋白變性和釋放，同時提高PCR反應的特異性。
[0021] 本發明實施例提供的用于血液直接熒光PCR擴增的反應液中，所述寡肽組分能保 護DNA聚合酶的酶活性，所述Bri j-58和Tween 20組分能增加細胞的通透性，破壞膜結構 和解聚蛋白質-DNA復合物，使血液中的血紅素、蛋白質和脂肪等抑制物變性，以降低其對 后續熒光PCR的抑制作用，所述甲酰胺組分除了能分離蛋白質-DNA復合物并使蛋白變性 和釋放外，還能提高PCR反應的特異性，此外還能夠促進DNA聚合酶活性的活性，使得熒光 PCR擴增能避開核酸提取純化過程，直接以血液為模版、在抗血液抑制作用的突變型DNA聚 合酶的作用下進行高效和特異的熒光PCR擴增。因此，不僅簡化了熒光PCR擴增的步驟，節 省了操作時間，同時降低成本、避免樣本間的交叉污染和減小了操作者感染的風險，實現高 效率、高成功率擴增檢測的目的。
[0022] 作為優選實施例，所述寡肽為六肽，所述六肽的組成形式為 AA1-AA 2-AA3-AA4-AA5-Aa6，本發明實施例提供的所述六肽，由于具有相對確定的肽長和結 構，對保護DNA聚合酶的酶活性明顯優于其他寡肽，其血液擴增效果好。作為進一步優選實 施例，通過發明人反復研究發現，所述的PCR反應液中的寡肽為Ser-Phe-Lys-Arg-Gly-Thr 時，其特定的空間結構、基團等，對保護DNA聚合酶的酶活性具有最佳效果。
[0023] 作為一個優選實施例，所述寡肽的濃度為3-20mg/ml，所述寡肽濃度過高，會影響 DNA聚合酶的酶活性，從而抑制PCR反應，如圖1所示，從左至右寡肽的濃度分別為18mg/ ml、12mg/ml、6mg/ml和24mg/ml的4條擴增曲線；所述寡肽濃度過高，則起不到保護DNA 聚合酶的作用。以所述PCR反應液的總重為100%計，所述PCR反應液中下列各組分的組 成為：Bri j-58 :0. 05-5%、Tween 20 :0. 5-0. 8%、甲酰胺：2-10%，在該濃度下，3 組分能破 壞血液細胞膜，使血紅素、蛋白質和脂肪等抑制物變性，濃度過低，變性不徹底，濃度過高， Bri j-58、Tween 20和甲酰胺都會對PCR反應起抑制作用，如圖2為從左至右Bri j-58濃 度分別為0.3%、0. 1 %和0.6%的3條擴增曲線；如圖3為從左至右TWeen20濃度分別為 0. 7 %、0. 5 %和0. 9 %的3條擴增曲線；如圖4為從左至右甲酰胺濃度分別為2 %、6 %和 10%的3條擴增曲線。
[0024] 進一步地，所述寡肽的濃度為14-16mg/ml。以所述PCR反應液的總重為100%計， 所述？〇?反應液中下列各組分的組成為出4」-58 :0.2-0.4%、了￥661120:0.7-0.8%、甲酰 胺：2-4% 〇
[0025] 作為最優實施例，所述寡肽的濃度為15mg/ml，以所述PCR反應液的總重為100% 計，所述？〇?反應液中下列各組分的組成為出4」-58 :0.25%、1￥661120:0.8%、甲酰胺： 3%〇
[0026] 作為本發明另一個實施例，所述PCR反應液中還包括下述組分：Tris-HCl、硫酸 銨、氯化鎂、dNTPs。其中，所述Tris-HCl能提供一個穩定的反應環境；所述硫酸銨中的NH/ 在高溫條件下可以生成NHJPH +，所述NH3有生成氫鍵的條件，可以破壞非特異退火的引物 和模板間的不穩定氫鍵，提高了退火的特異性；所述氯化鎂的Mg 2+為DNA聚合酶的輔助因 子，增加Taq酶活性，提高擴增效率；所述dNTPs為PCR反應DNA鏈的合成提高原材料。優 選的，下列各組分的濃度分別為：Tris-HCl :10-50mmol/L，pH9. 1 ;硫酸銨：10-50mmol/L ;氯 化鎂：2-5mmol/L ;dNTPs :100-600 ymol/L。
[0027] 本發明實施例中，所述PCR反應液中dNTPs的組成比例為：dATP: d