一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光pcr檢測方法及其引物，以及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光 PCR檢測方法及其引物，以及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 艱難梭菌（Clostridium difficile)是梭菌屬的一種專性厭氧菌，對氧十分敏感， 很難分離培養，故而得名。該菌發現于1935年，但直到1977年發現本菌與臨床長期使用某 些抗生素（氨芐青霉素、頭孢霉素、紅霉素、氯林可霉素等）引起的偽膜性腸炎有關，方被重 視。
[0003] 艱難梭菌廣泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型動物（牛、驢和馬） 的糞便，及狗、貓、嗤齒動物和人的糞便，除此之外還大量存在于水和動物的腸道中。嬰兒的 糞便中常含有艱難梭菌，為新生兒腸道中正常菌群，大約50% 12月齡嬰兒的腸道中有艱難 梭菌，2歲以上兒童的帶菌率大約為3 %，但此菌在健康成人中出現頻率較低，無癥狀帶菌 的成人在瑞典是1.9%，在日本為15. 4%。
[0004] 由于服用抗生素后，打破了腸內菌群的平衡，從而導致艱難梭菌累計了大量的數 量，產生大量的外毒素A和B。外毒素A由腸道毒素和細胞毒素組成。外毒素可綁定黏膜細 胞從而導致出血。而外毒素B是一種細胞毒素，在體內外毒素B不能與黏膜細胞直接綁定， 因為外毒素B只能與破壞的細胞綁定，導致更大的破壞。大多數艱難梭菌種屬都產生這兩 種毒素，從而在不同時期產生不同的作用，在初期外毒素A首先與黏膜細胞綁定，造成初級 的破壞，然后外毒素B進而發揮更大的破壞。
[0005]基于Taqman探針法的一步法焚光定量實時PCR (Realtime Fluorescence RT-PCR) 可以快速、靈敏、特異地檢出目的RNA片段，已經逐漸成為RNA病毒檢測的一個重要發展方 向。通過實時記錄探針標記基團受激發產生的熒光，實現了對PCR擴增過程實時監測，無需 電泳檢測，有效減少了PCR產物的氣溶膠污染和EB對環境的污染。而配合適當的buffer、 引物、探針，可以使靈敏度達到低至10個以內拷貝的檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的在于：提供一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測 方法的引物。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用的方案如下：
[0008] -種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的引物，所述的艱難梭狀芽 孢桿菌毒素包括艱難梭狀芽孢桿菌毒素A和艱難梭狀芽孢桿菌毒素B，所述艱難梭狀芽孢 桿菌毒素A基因的熒光PCR檢測方法的上游引物核苷酸序列SEQIDN0. 1，其下游引物核苷 酸序列SEQIDN0. 2,其熒光探針引物核苷酸序列SEQIDN0. 3;
[0009]上游引物：tcdA-F :5' -GCAGTCGGATTGCAAGTAATTG-3'（SEQIDNO. 1);
[0010] 下游引物：tcdA-R :5' -GTCTGCCAACCmTGAGATGAT-3'（SEQ ID NO. 2);
[0011] 熒光探針：tcdA-P :5' -VIC-ATITCAATCCTGACACTGC-MGB-3'（SEQ ID NO. 3)
[0012] 所述艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基因的熒光PCR檢測方法的上游引物核苷酸序列 SEQ ID N0. 4,其下游引物核苷酸序列SEQ ID N0. 5,其熒光探針引物核苷酸序列SEQ ID NO. 6 ；
[0013] 上游引物：tcdB-F :5' -TGCAGCCAAAGTTGTTGAATTAGT-3'（SEQ ID NO. 4);
[0014] 下游引物：tcdB-R :5' -CTGCACCTAAACTTACACCATCTATAATAGT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0015] 熒光探針：tcdB-P :5' -VIC-TCAACTGCATTAGATGAAA-MGB-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0016] 相對于現有技術，本發明的基因引物具有相應的特異性能好，長度合適，轉錄高 效，不會形成二級結構，引物自身少于連續4個堿基的互補，采用本發明引物測試的符合率 高達98. 6%，測靈敏度可以達到100copies/mL。
[0017] 本發明的第二個目的在于，提供一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測 方法，為實現本發明目的，采用以下技術方案，
[0018] 本技術方案包括以下步驟，
[0019] S1、提取待測樣本中的DNA，即標本DNA ;
[0020] S2、以標本DNA為模板，使用艱難梭狀芽孢桿菌毒素A基因的上游引物、下游引物、 熒光探針引物進行PCR擴增；
[0021] 和艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基因的上游引物、下游引物、熒光探針引物進行PCR擴 增，
[0022] S3、對擴增產物分別進行熒光定量PCR檢測；
[0023] S4、結果分析：反應結束后，根據待測樣品的熒光循環閾值（Ct)判斷待測樣品是 否為艱難梭狀芽孢桿菌毒素A、艱難梭狀芽孢桿菌毒素B陽性。
[0024] 作為本發明一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的一種改進，所 述的標本DNA提取，具體步驟為用棉拭子沾取適量艱難梭狀芽孢桿菌核酸提取液，加入艱 難梭狀芽孢桿菌DNA提取液快速攪動4-5秒，振蕩混勻，100度水浴10分鐘，12000rpm離心 5分鐘。
[0025] 作為本發明一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的一種改進，還 包括陽性質控品的制備，以提取的艱難梭狀芽孢桿菌陽性標本DNA為模版，進行擴增，將產 物挑取進行TA克隆，其中PCR擴增使用AmpliTaqGold?360 Master Mix，按說明書推薦 反應程序完成
[0026] 具體為：反應后取5yl PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，將切膠純化 的PCR產物與載體連接，重組質粒涂布于培養皿上，轉化感受態細胞，挑取陽性菌落抽提質 粒，按比例稀釋，作為熒光定量PCR檢測的陽性質控品。
[0027] 作為本發明一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的一種改進，所 述的PCR擴增，具體為：
[0028] 對于每個樣本，需同時檢測艱難梭狀芽孢桿菌毒素A基因以及艱難梭狀芽孢桿菌 毒素B基因，即分別用艱難梭狀芽孢桿菌毒素A基因反應液或艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基 因反應液，加入混合的酶液（含1U/ y L的Taq酶、1U/ y L的UDG酶）1 y L，然后加入陽性質 控品DNA 4 y 1 ;將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，設置各檢測的名稱和熒光基團 種類（target選擇VIC，淬滅基團選擇NFQ-MGB)，設定循環條件：50°C 5分鐘；95°C 10分 鐘；95°C 15秒，52°C 30秒，63度60s(此步驟采集熒光信號），各40個循環。
[0029] 作為本發明一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的一種改進， 所述艱難梭狀芽孢桿菌毒素A基因反應液組成如下：艱難梭狀芽孢桿菌毒素A qPCR Mix 20 y 1、聚合酶（Taq酶）和尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）混合液1 y 1 (含Taq酶和UDG 酶各1U)，以及提取的標本DNA4yl ;其中艱難梭狀芽孢桿菌毒素A qPCR Mix中還含有qPCR 緩沖液、三磷酸脫氧尿甘（dUTP);
[0030] 所述的所述艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基因反應液組成如下：艱難梭狀芽孢桿菌毒 素A qPCR Mix 20 y 1、聚合酶（Taq酶）和尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）混合液1 y 1 (含 Taq酶和UDG酶各1U)，以及提取的標本DNA4 y 1 ;其中艱難梭狀芽孢桿菌毒素B qPCR Mix 中還含有qPCR緩沖液、三磷酸脫氧尿甘（dUTP)。
[0031] 作為本發明一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR檢測方法的一種改進，所 述的結果分析為
[0032] S1、設置基線：根據機型不同，設置3-15循環，6-15循環，特殊情況可對基線適當 調整。
[0033] S2、設置閾值：以閾值線剛超過陰性對照擴增曲線（無規則的噪音線）的最高點。
[0034] S3、結果判斷
[0035] 陽性：檢測樣本Ct值小于等于35. 0,且曲線有明顯的指數增長期；
[0036] 可疑：檢測樣本Ct值大于35. 0且小于40. 0,重復一次實驗，如果Ct值仍小于 40. 0,且曲線有明顯的指數增長期，為陽性，否則為陰性；
[0037] 陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40。
[0038] 相對于現有技術，本發明方法能夠簡單方便地提取出標本中的艱難梭菌DNA，如糞 便標本，并對艱難梭狀芽孢桿菌毒素A和艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基因進行檢測，該方法使 用特異性的擴增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而 避免了抗體及培養檢測方法特異性不足，避免了誤測的問題。
[0039] 本發明的第三個發明目的在于，提供一種艱難梭狀芽孢桿菌毒素基因的熒光PCR 檢測方法的試劑盒，
[0040] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案
[0041] 該技術方案包括以下試劑
[0042] 所述的TcdA qPCR緩沖液、TcdB qPCR(實時熒光定量核酸擴增檢測系統）緩沖液 先配制成濃度為2mol，含有以下成分：
[0043] 64mM HEPES (pH7. 8)(單一組成）、
[0044] 8mM MgCl2、
[0045] 100mM KC1
[0046] 0? 2mM 甜菜堿
[0047] 0.2mg/mL 海藻糖
[0048] 所述qPCR實時熒光定量核酸擴增檢測系統組成為：
[0049]
[0050] 所述檢測試劑盒的提取試劑的方案是，DNA提取液含有：
[0051]
[0052] 現對于現有技術本發明結果證實本試劑盒檢測靈敏度可以達到lOOcopies/mL，將 該試劑盒檢測出的陽性用傳統的培養法進行鑒定，僅檢出其中2/3的標本，由此，該熒光定 量PCR的方法敏感度遠遠高于普通的方法。本發明選擇確定核酸為陽性的沙門氏菌、志賀 氏菌標本以及用life公司生產的艱難梭菌熒光定量PCR檢測試劑盒（M105en_Lyra Direct C. diff Assay，通過FDA認證）驗證過的72例陰性標本，沙門氏菌、志賀氏菌檢測結果均為 陰性，72例標本僅一例（弱陽性）與life試劑盒（陰性）結果不符，符合率為98. 6%。
【附圖說明】
[0053] 圖1為本發明艱難梭狀芽孢桿菌毒素A基因檢測的敏感性實驗圖。
[0054] 圖2為本發明艱難梭狀芽孢桿菌毒素B基因檢測的敏感性實驗圖。
【具體實施方式】
[0055] 下面將結合【具體實施方式】和說明書附圖對本發明及其有益效果作進一步詳細說 明，但是，本發明的【具體實施方式】并不局限于此。
[0056] 本發明【具體實施方式】如下：
[0057] 1、特異性引物及探針的設計
[0058] 2、根據從Genbank上檢索