一種3α-HSD試劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生化檢測領域，具體的，涉及一種3 a -HSD試劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 3 a -輕類固醇脫氫酶（3 a-HSD，EC. 1. 1. 1. 50)，是睪酮假單胞菌（comamonas pseudomonas testosteroni, CPT)產生一種類固醇脫氫酶。它可作用于多種類固醇基質，可 逆地催化C19-27類固醇3位羥基/酮基的氧化還原反應。3 a -HSD由225個氨基酸組成， 分子量為26. 4KD。3 a -HSD應用到體外診斷試劑中，作為工具酶發揮其催化作用。例如，在 總膽汁酸測定技術中，3 a -HSD可以與Thio-NAD -起特異性氧化膽汁酸，生成3-酮類固醇 和還原性輔酶（NADH)又生成膽汁酸和氧化型輔酶（NAD)每一次循環比原來的反應提高一 倍的靈敏度，如此往復循環，從而放大微量的膽汁酸，產生大量的水溶性非染料的硫代還原 型輔酶（Thio-NADH)，最后測定生成的Thio-NADH的吸光度變化，測得總膽汁酸的含量。此 外，在環境中眾多類固醇激素物質的刺激下，睪酮假單胞菌大量表達3 a-HSD，通過多酶的 氧化留核的復雜代謝途徑，完全消化這類底物，因此3 a -HSD在這些危害大的穩定化合物 的生物修復中起重要作用。
[0003] 現有的3 a -HSD試劑溶液一般由三（羥甲基）氨基甲烷（Tris)緩沖液、3 a -HSD、 EDTA. 2Na和二價離子（MgCl2、CaCL2)等組成，其在實際應用中存在穩定時間較短的缺陷：在 2_8°C開蓋使用狀態，測定結果準確性降低；在2-8°C密閉避光保存過程中，隨著放置時間 的延長，試劑顏色由無色逐漸變為紅色，試劑在穩定性方面的這種缺陷，使得測定結果準確 性降低，也造成原料的浪費，不能滿足檢測的要求。
[0004] 因此有必要提供一種新的、穩定性高的3 a -HSD溶液，以滿足實際應用的要求。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有的3 a -HSD試劑存在的穩定時間短的缺陷，提供一種 在2-8°C開蓋使用狀態下和在2-8°C密閉避光存儲過程中的持續穩定的3 a -HSD試劑。
[0006] 為達到以上目的，本發明提供了一種3 a -HSD試劑，所述試劑的組成成分包括：
[0007] 3a_HSD、表面活性劑、緩沖液和穩定劑；所述緩沖液選自2_(環己胺）乙磺酸、 3-(環己胺）_1_丙磺酸、3-(環己胺）-2-羥基-1-丙磺酸、N-三（羥甲基）-3-氨基丙烷 磺酸、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸和三乙醇胺中的一種。
[0008] 可選的，所述表面活性劑選自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇對異辛基苯基醚、 聚乙二醇單月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烴基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二 醇醚所組成的組中的一種或兩種。
[0009] 可選的，所述穩定劑選自半胱氨酸、L-還原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧 化型谷胱甘肽二鈉鹽和牛血清白蛋白所組成的組中的一種。
[0010] 可選的，在所述試劑中，3a -HSD的濃度為0. 5-100KU/L，優選為5-20KU/L ;緩沖液 的終濃度為5-500mmol/L，優選為10-100mm〇l/L ;表面活性劑的濃度以質量體積百分含量 計為0.05-20% (w/v)，優選為1-15% (w/v);穩定劑的濃度為l-20g/L，優選為3-15mmol/ L〇
[0011] 可選的，所述緩沖液的緩沖容量為〇. 05-lmol/L。
[0012] 可選的，所述3 a -HSD試劑的pH為8. 0-9. 5。
[0013] 可選的，所述緩沖液為N-三（羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸，所述穩定劑為L-還原 型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一種，所述表面活性劑為聚氧乙烯十二烷基醚 (EMULGEN109P)和聚乙二醇對異辛基苯基醚（曲拉通TX-100)中的至少一種。
[0014] 本發明還提供了所述3 a -HSD試劑的制備方法：將緩沖液、表面活性劑、穩定劑、 3 a -HSD依次加入到混合容器中進行分步混合，得到均勻的穩定相。
[0015] 本發明還提供了所述3 a -HSD試劑的應用，包括制備總膽汁酸測定試劑和酶體外 定向分子進化技術的研究。
[0016] 通過上述技術方案，本發明所提供的3 a -HSD試劑在2_8°C開蓋使用狀態下的穩 定時間可以達到15-30天；在2-8°C密閉避光存儲過程中的穩定時間可以達到10-15個月。
【具體實施方式】
[0017] 下面將通過【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給 出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技術人員在 不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0018] 本發明提供了一種3 a -HSD試劑，所述試劑的組成成分包括：
[0019] 3 a -HSD、表面活性劑、緩沖液和穩定劑；所述緩沖液選自2_(環己胺）乙磺酸緩沖 液、3-(環己胺）_1_丙磺酸緩沖液、3-(環己胺）-2-羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲 基）_3_氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液中 的一種。
[0020] 其中，3 a -HSD、表面活性劑和穩定劑均溶解于緩沖液中形成穩定且均一的溶液。
[0021] 在本發明中，所述緩沖液的終濃度表示利用3 a -HSD、表面活性劑、緩沖液和穩定 劑等組分配制所述試劑后，試劑中起緩沖作用的有效成分的終濃度，例如，當所述緩沖液為 N-三（羥甲基）-3-氨基丙烷磺酸時，緩沖液的終濃度表示配制獲得的試劑中N-三（羥甲 基）-3-氨基丙烷磺酸的濃度。當緩沖液由兩種或兩種以上有效成分組成時，緩沖液的終濃 度指代幾種有效成分的總濃度。
[0022] 在本發明的一種實施方式中，所述緩沖液的緩沖容量為0.05-lmol/L。為了獲 得更好的穩定效果，緩沖液優選為N-三（羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)或3-(環己 胺）_1_丙磺酸（CAPS)。
[0023] 可選的，所述試劑的pH為8. 0-9. 5,優選的，為了獲得更好的試劑穩定效果，所述 試劑的pH為9. 0-9. 5。
[0024] 在本發明中，所述表面活性劑選自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇對異辛基苯 基醚、聚乙二醇單月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烴基乙二醇醚系列和烷基聚 乙烯乙二醇醚所組成的組中的一種或兩種。優選的，所述表面活性劑為聚氧乙烯十二烷基 醚（EMULGEN109P)和/或聚乙二醇對異辛基苯基醚（曲拉通TX-100)。
[0025] 其中，在本發明的一種實施方式中，所述烷基聚烯烴基乙二醇醚指代脂肪醇環氧 乙烷-環氧丙烷的加成物，如PR0PETAL100。
[0026] 可選的，所述穩定劑選自由半胱氨酸、L-還原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、 L-氧化型谷胱甘肽二鈉鹽和牛血清白蛋白所組成的組中的一種。優選的，為了獲得最佳的 穩定效果，所述穩定劑選自L-還原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一種。
[0027] 可選的，在所述試劑中，3a -HSD的濃度為0. 5-100KU/L，優選為5-20KU/L ;緩沖液 的終濃度為5-500mmol/L，優選為10-100mmol/L ;表面活性劑的濃度為0. 05-20% (w/v)，優 選為1-15% (w/v);穩定劑的濃度為l-20g/L，優選為3-15g/L。
[0028] 在本發明的一種優選的實施方式中，所述緩沖液為N-三（羥甲基）_3_氨基丙烷 磺酸（TAPS)緩沖液，所述穩定劑為L-還原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽和牛血清白蛋 白中的至少一種，表面活性劑為聚氧乙烯十二烷基醚（EMULGEN109P)和聚乙二醇對異辛基 苯基醚（曲拉通TX-100)中的至少一種。
[0029] 可選的，所述試劑還包括防腐劑NaNjP Pr〇clin300,所述防腐劑的濃度可以為 0. l-2g/L ;所述防腐劑可以為NaN3，當所述防腐劑為似隊時，其濃度為0. l-2g/L。
[0030] 本發明還提供了所述3 a -HSD試劑的制備方法：將上述緩沖液中的一種、表面活 性劑中的至少一種、穩定劑