一種區域選擇性專一的轉糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種區域選擇性專一的轉糖基e -N-乙酰氨基已糖苷酶的應用，特別 涉及一種0 -N-乙酰氨基已糖苷酶專一性合成N-乙酰已糖胺寡糖的應用，屬于糖苷酶應用
技術領域。 技術背景
[0002] 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶（0 -N-acetylhexosaminidases，EC. 3. 2. 1. 52)是一類 重要的糖苷水解酶，催化0-N-乙酰氨基已糖苷鍵的水解，廣泛分布于細菌、真菌，植物和 動物中，根據氨基酸序列同源性歸屬于糖苷酶家族GH3、GH20和GH84(http://www. cazy. org/)。其中，細菌來源的0-N-乙酰氨基已糖苷酶在三個家族中均有分布，真核生物來 源的主要屬于GH20。該類酶既可以水解簡單的P-N-乙酰氨基已糖苷，也可以作用于含 P-N-乙酰氨基已糖苷鍵的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些P-N-乙酰氨基已 糖苷酶不僅具有水解功能，在體外合適的反應條件下還具有轉0-N-乙酰氨基已糖苷的活 性，合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物，應用于基礎研究、農業和醫藥等領域，但目前報道 的酶轉糖基區域選擇性不嚴格，合成產物存在同分異構體，不利于產物純化，并且產物產量 很低。
[0003] N-乙酰已糖胺寡糖的合成具有重要意義，如寡糖GlcNAcP l-3GalP l-4Glc (即 lacto-N-triosell)是存在于母乳低聚糖和很多血型抗原中的糖鏈結構，但目前糖苷酶法 合成產率很低，不超過10% ;寡糖GalNAcP l-3GalP l-4Glc是血型P抗原的類似物，但目 前糖苷酶法合成還是空白。由于現有的合成方法均存在局限性，使得N-乙酰已糖胺寡糖的 商品價格一直非常昂貴，需要尋找新的酶源和經濟有效的合成方法。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術的不足，提供一種0-1，3區域選擇性專一的高效轉糖基 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的應用。
[0005] 發明概述
[0006] 本發明的技術要點是利用區域選擇性專一的0 -N-乙酰氨基已糖苷酶以對硝基 苯-N-乙酰-D-已糖胺為糖基供體，以乳糖為受體，一步轉糖基反應高效合成單一的 N-乙酰已糖胺寡糖產物。
[0007] 發明詳述
[0008] -種區域選擇性專一的轉糖基P-N-乙酰氨基已糖苷酶的應用，所述轉糖基 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的表達基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 上述應用，步驟如下：
[0010] 將轉糖基e -N-乙酰氨基已糖苷酶與對硝基苯-N-乙酰-e -D-已糖胺和乳糖溶 液混合，配制成反應體系，在45~55°C條件下，反應1. 5~4h，終止反應，純化，制得N-乙 酰已糖胺寡糖。
[0011] 根據本發明優選的，所述轉糖基e -N-乙酰氨基已糖苷酶的制備方法如下：
[0012] (1)將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基因序列插入質粒pET-21b中，轉化大腸 桿菌BL21 (DE3)，制得重組大腸桿菌；
[0013] (2)將步驟（1)制得的重組大腸桿菌經擴大培養，再經過誘導培養后，收集細胞， 細胞破碎、純化，制得轉糖基P-N-乙酰氨基已糖苷酶。
[0014] 經檢測，轉糖基P-N-乙酰氨基已糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。該 轉糖基0 -N-乙酰氨基已糖苷酶單亞基分子量為170kDa，專一性水解0 -N-乙酰氨基已糖 苷鍵，以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄糖胺為底物時，最適pH為5. 0~7. 0,在pH4. 0~ 11. 0范圍內穩定，適宜的反應溫度為45°C~55°C，在低于55°C時穩定；Zn2+和Hg 2+顯著抑 制酶活，NH4+、Na+、Mg 2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu 2+、Co2+、Ca2+對酶有激活作用，EDTA 對酶活性沒 有抑制作用。
[0015] 根據本發明進一步優選的，所述步驟（1)中，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基 因序列以兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因組DNA為模板，經PCR 擴增獲得，PCR引物核苷酸序列如下所示：
[0016] 引物 F:5' -agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3?
[0017] Hind III
[0018] 引物 R:5' -atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3?
[0019] Xho I
[0020] PCR體系如下（總體積100 y L):
[0021] 10XPCR buffer 10 y L，2. 5mmol/L dNTP 8 y L、20 ymol/L 引物各 2 y L、100ng/ y L 模板 1 y L、5U/ y L TaKaRa LA Taq 酶 1 y L，超純水 76 y L。
[0022] PCR擴增程序如下：
[0023] 95 °C預變性5分鐘；95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸5分鐘，反應30個 循環；72°C延伸10分鐘。
[0024] 根據本發明進一步優選的，所述步驟（2)中，擴大培養條件為：37°C、150~180r/ min培養至0D6。。為0. 4~0. 6。
[0025] 根據本發明進一步優選的，所述步驟（2)中，擴大培養基為LB培養液，配制方法如 下：
[0026]蛋白胨 10g/L、酵母膏 5g/L、NaCl 7g/L、pH 7. 0,121°C滅菌 20 分鐘。
[0027] 更優的，所述擴大培養基還包括濃度為40~60 y g/mL的氨芐霉素。
[0028] 根據本發明進一步優選的，所述步驟（2)中，誘導培養為在擴大培養后，向培養液 中加入IPTG，使培養液中IPTG的濃度為0. 5mM~ImM，在25~28°C、100r/min繼續過夜培 養。
[0029] 根據本發明優選的，所述反應體系中，對硝基苯-N-乙酰-D-已糖胺的反應濃 度為10~20mM，乳糖反應濃度為300~400mM，pH為5. 0~6. 0。
[0030] 根據本發明優選的，所述反應體系由濃度為50mM的磷酸鈉緩沖液配制，pH為5. 8。
[0031] 根據本發明優選的，所述純化采用柱層析進行純化。
[0032]有益效果
[0033] 本發明提供了一種區域選擇性專一的P -N-乙酰氨基已糖苷酶高效合成N-乙酰 已糖胺寡糖的方法，所采用的0-N-乙酰氨基已糖苷酶在以乳糖為受體底物的反應體系中 專一性合成 GlcNAc 0 l-3Gal 0 l-4Glc 或 GalNAc 0 l-3Gal 0 l-4Glc，獲得單一寡糖產物，不 存在其他異構產物的干擾，避免了異構體純化的復雜步驟，真正適合于N-乙酰已糖胺寡糖 的規模化合成及分離制備純品，具有潛在的應用前景。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明制備的轉糖基0 -N-乙酰氨基已糖苷酶電泳圖；
[0035] 其中，M、分子量標準；1、含0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的重組菌的粗細胞酶液；2、對 照重組菌的粗細胞酶液；3、純化轉糖基0 -N-乙酰氨基已糖苷酶；
[0036] 圖2為0-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-半乳 糖胺為供體合成產物的質譜；
[0037] 圖3為0 -N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-半乳 糖胺為供體合成產物的核磁氫譜圖；
[0038] 圖4為0-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-半乳 糖胺為供體合成產物的核磁碳譜圖；
[0039] 圖5為0-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄 糖胺為供體合成產物的質譜；
[0040] 圖6為0-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄 糖胺為供體合成產物的核磁氫譜圖；
[0041] 圖7為0-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖為受體、以對硝基苯-N-乙酰-0 -D-葡萄 糖胺為供體合成產物的核磁碳譜圖。
【具體實施方式】
[0042] 下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于 此。
[0043] 生物材料來源
[0044] 兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)JCM1254來源于日本微生物菌種保藏 中心（JapanCollection of Microorganisms)；
[0045]質粒pET_21b購自 Novagen 公司。
[0046] 實施例1
[0047] -種區域選擇性專一的轉糖基0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的應用，步驟如下：
[0048] 1. 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶的制備
[0049] 根據兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)JCM1254預測的0-N-乙酰氨基 已糖苷酶基因序列（GenBank Accession No. AB504521.1)設計引物F和引物R:
[0050] 引物 F:5' -agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3?
[0051] Hind III
[0052] 引物 R: ：5? -atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3?
[0053] Xho I
[0054] 以兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因組為模板，PCR擴增 0 -N-乙酰氨基已糖苷酶基因片段，PCR體系如下（總體積100 y L):
[0055] 10XPCR buffer 10 y L，2. 5mmol/L dNTP 8 y L、20 ymol/L 引物各 2 y L、100ng/ y L 模板 1 y L、5U/ y L TaKaRa LA Taq 酶 1 y L，超純水 76 y L。
[0056] PC