用于高效基因傳遞的葡聚糖肽混合物的制作方法
【專利說明】用于高效基因傳遞的葡聚糖肽混合物 相關申請的交叉引用
[0001] 本申請要求2014年2月14日提交的美國臨時專利申請序列號為61/939,951，標 題為"用于高效基因傳遞的葡聚糖肽混合物"的優先權，將該專利申請的全部內容并入本申 請中作為參考。
技術領域
[0002] 本發明的一種或多種實施方式涉及一種用于基因傳遞的新的組合物。在某些實施 方式中，本發明涉及具有一個或多個含有陽離子肽側鏈的多糖聚合物，該側鏈可復合并傳 遞核酸至細胞。 政府的支持
[0003] 本發明至少部分是由美國國家科學基金會（NSF)的授權號DMR-1206923的支持而 研發的。美國政府可擁有本發明的某些權利。 序列表
[0004]序列表文件 UOA. llll.US Sequence Listing_ST25. txt，具有 1，759 字節大小，制 作日期為2015年1月21日，其隨本申請一起通過電子提交，全部內容并入本申請中作為參 考。
【背景技術】
[0005] 在過去的二十年中，由于基因療法是一種用于治療目前認為是不治之癥的基因疾 病或者獲得性疾病的有前途的策略，因此，基因療法已經顯著引起了人們的興趣。基因治 療的成功依賴于安全和高效的基因傳遞系統。這些系統必須具有以下特征，DNA保護，細胞 攝取，內體脫離作用（endosomal escape)和低毒性，以克服基因治療中的障礙。迄今為止， 已經開發了各種傳遞系統，它們可分為兩類：病毒和非病毒載體，非病毒載體的效率不如 病毒載體，但是由于非病毒載體可以避免與病毒相關的問題，包括生產的復雜性、免疫原性 (immunogenicity)和誘變（mutagenesis)，其提供了較安全的傳遞策略。目前，大部分的非 病毒載體由合成材料制得，如陽離子脂質，聚合物和樹枝狀聚合物（dendrimer)。它們中的 一些可以在體外高效誘導轉染；然而，這些系統中的許多在體內具有較高的毒性，較低的生 物降解性和較差的生物相容性。
[0006] 已研究得出天然材料（如陽離子多糖和肽）可作為潛在的基因傳遞攜帶者以避免 基于合成材料的攜帶者相關的慢性毒性。由于脫乙酰殼多糖（Chitosan)的生物相容性，已 廣泛研究其可作為基因傳遞攜帶者，但是，但它的轉染效率仍不能令人滿意并且在中性條 件下的溶解度較低。天然氨基酸組成的肽載體與生物環境相容，較低的細胞毒性和生物可 降解性。由于不同的屬性氨基酸塊可提供給我們開發具體所需的功能的多功能藥物攜帶者 的自由，因此，這些載體對合理的設計是適用的。例如，在生理環境中帶正電荷的精氨酸殘 基已被用于凝結帶負電荷的治療性DNA或RNA。將組氨酸殘基引入到肽中以幫助DNA的脫 離內體，從而提高轉染效率。先前的研究表明，具有肽配體序列的集成肽能夠實現靶向基因 傳遞至特定細胞。然而，該肽的尺寸必須超過一定的值以容納所有需要的功能，這將極大地 增加肽的成本。
[0007] 一般地，天然聚合物基的基因攜帶者的進一步發展存在三個主要障礙，首先，所有 報告基因藥物載體僅僅提供了所需的部分功能，如高轉染效率，長期的血液循環和有效的 靶向特性；其次，一般地，天然聚合物的基因轉染效率一直很低；第三，這些天然聚合物基 的攜帶者的載藥效率也一直很低，因此最佳的基因轉染是在相對較高的N/P比下實現的。 所需要的技術是使用可生物降解的，有效率的和集成的天然聚合物并具有高轉染效率，長 期的血液循環和有效的靶向特性的基因傳遞系統。
【發明內容】
[0008] 本發明的一種或多種實施方式提供了一種用于基因傳遞的新的組合物，涉及一組 具有一個或多個含有陽離子肽的核酸傳遞側鏈的多糖聚合物。在某些實施方式中，這些陽 離子肽凝結并物理鍵合到一種或多種核酸上以形成允許核酸傳遞并轉染進細胞內的多糖 核酸復合體（polysaccharide-nucleic acid complex)。在某些實施方式中，本發明的多糖 聚合物也可具有一個或多個兩性離子側鏈和/或反應性側鏈。
[0009] 第一方面，本發明涉及用于核酸傳遞的多糖聚合物組合物，其含有：多糖聚合物鏈 和一個或多個鍵合到所述多糖聚合物鏈的核酸傳遞側鏈，其中，所述一個或多個核酸傳遞 側鏈還含有陽離子肽。在本發明的第一方面的一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物 還含有一個或多個物理鍵合到所述陽離子肽的核酸以形成多糖核酸復合體。
[0010]在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述 實施方式中的任意一種或多種，其中，所述多糖聚合物鏈含有葡聚糖，纖維素，淀粉，葡萄 糖胺聚糖（glycosaminoglycans)，甘露聚糖，糊精，瓊脂，瓊脂糖（agarose)，藻酸，多糖 酸（alguronic acid)，直鏈淀粉，a-葡聚糖，支鏈淀粉，葡聚糖，胼胝質，角叉菜膠， 纖維糊精，殼多糖，脫乙酰殼多糖，金藻昆布多糖（chrysolaminarin)，環糊精，DEAE-瓊脂 糖，聚鹿糖，果聚糖，褐藻糖膠（fucoidan)，半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan)，半乳 甘露聚糖，結冷膠（gellan gum)，葡聚糖，葡甘露聚糖，葡糖醛酸，糖萼，糖原，半纖維素，同 聚多糖，羥丙甲纖維素，菊粉，海帶多糖（laminarin)，香菇多糖，果聚糖多糖，地衣淀粉， 混合聯動葡聚糖，裸藻淀粉（paramylon)，果膠酸，果膠，噴他淀粉（pentastarch)，藻糖原 (phytoglycogen)，平燕0 -葡聚糖（pleuran)，聚右旋糖，多糖肽，卟啉，普魯蘭多糖，瓊脂 糖凝膠（sepharose)，木聚糖，木葡聚糖，酵母聚糖，透明質酸，肝素或它們的組合。在一種或 多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實施方式中的任意一 種或多種，其中，所述多糖聚合物鏈可具有約500道爾頓至約1，000, 000道爾頓的重均分子 量。
[0011] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，所述一個或多個核酸傳遞側鏈還含有甲基丙烯酸酯，丙 烯酸酯，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酰胺，丙烯酰胺，馬來酰亞胺，鹵乙酰，和吡啶基二硫化物， 硫醇或它們的組合。
[0012] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，每個所述一個或多個核酸傳遞側鏈上的陽離子肽為具 有選自由 CWR5, CWR3H3, CWK5, CWK3, CWR5H5, CWR3H3, CWK5H5, CWK3H3,（；!?"，CwKn，GH，C wKpHq，或者 CwRxKyHz組成的組的結構式的無規共聚物；其中，C是半胱氨酸，R是精氨酸，K是賴氨酸，H 是組氨酸，并且m，n，〇, p，q，x，y，z和w是1至1000的整數。在一種或多種實施方式中， 多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實施方式中的任意一種或多種，其中， 每個所述一個或多個核酸傳遞側鏈上的陽離子肽為具有選自由CR 5, CR3H3, CH3R3, CK5, CK3， CH5R5(SEQ. ID No. 1)，CR5H5(SEQ. ID No. 2)，CR3H3, CH3R3, CK5H5(SEQ. ID No. 3)，CH5K5(SEQ. ID No. 4)，CK3H3, CH3K3, R5C，R3H3C，K5C，K3C，R 5H5C(SEQ. ID No. 5)，R3H3C，K5H5C(SEQ. ID No. 6)， K3H3C，OC CKn，CH，CKpHq，或CRxKyH z組成的組的結構式的嵌段共聚物；其中，C是半胱氨酸， R是精氨酸，K是賴氨酸，H是組氨酸，并且m，n，〇, p，q，x，y，z和w是1至1000的整數。
[0013] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，所述陽離子肽含有約1至約10000個精氨酸殘基，約1 至約10000個組氨酸殘基和至少一個半胱氨酸殘基。在一種或多種實施方式中，多糖聚合 物組合物可含有本發明的第一方面的上述實施方式中的任意一種或多種，其中，所述陽離 子肽含有約1至約10000個賴氨酸殘基，約1至約10000個組氨酸殘基和至少一個半胱氨 酸殘基。在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，所述陽離子肽具有結構式NH 2-RRRRRHHHHHC-C00H(SEQ. ID No. 5)〇
[0014] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，所述一個或多個核酸傳遞側鏈還含有結合到所述多糖 聚合物鏈上的連接分子，其中，所述陽離子肽通過硫醇鍵鍵合到所述連接分子上。
[0015] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，多糖核酸復合體具有約1:1至約1〇〇:1的N/P比。在一 種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實施方式中的任 意一種或多種，其中，多糖核酸復合體具有約1:1至約10:1的N/P比。
[0016] 在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述實 施方式中的任意一種或多種，其中，所述一種或多種核酸含有核糖核酸，脫氧核糖核酸或它 們的組合。在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明的第一方面的上述 實施方式中的任意一種或多種，其中，所述一種或多種核酸含有選自由質粒DNA，寡核苷酸， 適體，DNA核酶，RNA適體，RNA誘餌，反義RNA，核酶，小干擾RNA (siRNA)，microRNA (miRNA)， 短發夾RNA，miRNA詰抗劑（Antagomirs)，和它們的組合。
[0017] 第二方面，本發明涉及任意一種或多種上述第一方面的多糖聚合物組合物，其還 含有一個或多個兩性離子側鏈。在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發 明的第二方面的上述實施方式中的任意一種或多種，其中，所述一個或多個兩性離子側鏈 還含有兩性離子基團，所述兩性離子基團含有羧基甜菜堿基團，磺基甜菜堿基團，磷基甜菜 堿基團或者它們的任意組合。在一種或多種實施方式中，多糖聚合物組合物可含有本發明 的第二方面的上述實施方式中的任意一種或多種，其中，所述兩性離子基團具有相應的陽 離子環的形狀。
[0018]第三個方面，本發明涉及任意一種或多種上述第一和第二方面的多糖聚合物組合 物，其還含有一個或多個反應性側鏈，該反應性側鏈含有選自由丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯， 甲基丙烯酰胺，丙烯酰胺，馬來酰亞胺，鹵乙酰（haloacetyls)，吡啶基二硫化物，硫醇和它 們的組合組成的組的化合物。
【附圖說明】
[0019] 為了更完整地理解本發明的特征和優點，現結合本發明的附圖對其進行如下的詳 細描述：
[0020] 圖1為根據本發明的一種或多種實施方式的重水（D20)中Dexl0_R 5H5(20% )的 300MHz 蟲 NMR 圖譜。
[0021] 圖2為根據本發明的一種或多種實施方式的重水（D20)中Dexl0_R 5H5(40% )的 300MHz 蟲 NMR 圖譜。
[0022] 圖3為根據本發明的一種或多種實施方式的重水（D20)中Dex20_R 5H5(10% )的 300MHz 蟲 NMR 圖譜。
[0023] 圖4為根據本發明的一種或多種實施方式的重水（D20)中Dex20_R 5H5(20% )的 300MHz 蟲 NMR 圖譜。
[0024] 圖5為根據本發明的一種或多種實施方式的重水（D20)中Dex70_R 5H5(10% )的 300MHz 蟲 NMR 圖譜。
[0025]圖 6A-E 的圖像分別顯示了在 N/P 比為 0，1，5，10,20 和 30 下，Dexl0-R5H5(20% )/ DNA(6A),Dexl0-R5H5(40%)/DNA (6B),Dex2〇-R5H5 (10%)/D NA (6C),Dex2〇-R5H5 (20% )/ DNA(6D)和Dex70-R5H5(10% )/DNA(6E)復合體中的DNA的電泳迀移率檢測的結果。
[0026]圖 7A-B 顯示了由（7A) Dexl〇-R5H5 (20 % ) /DNA ( 0 ):, Dexl〇-R5H5 (40 % ) /DNA (興， Dex20-R5H5(10% )/DNA(?)，和 Dex20-R5H5(20% )/DNA(目）和（7B)Dex70-R5H5/DNA 在 SK0V3 細胞株系中誘導的熒光素酶的表達水平的柱狀圖，在N/P為5下的DNA和PEI-DNA分別用 作陰性對照和陽性對照，誤差棒表示4個重復的標準偏差。*，**P〈0. 05。
[0027] 圖8A-B顯示了 N/P為5的DNA和PEI-DNA復合體與不同N/P比的（8A) Dexl0-R5H5(20% )/DNA：(MDexl〇-R5H5 (40% )/DNA( ? ),Dex2〇-R5H5(10% )/DNA|H)^P Dex20-R5H5 (20 % ) /DNA;(:目):復合體和（8B) Dex70-R5H5/DNA孵育后的SK0V3細胞株系的細胞 存活率比較的柱狀圖，DNA濃度為5yg/mL，誤差棒表示8個重復的標準偏差。*，**P〈0. 05。
[0028] 圖9為顯示miRNA拮抗劑與Dexl〇-R5H 5 (40% )在不同N/P下復合以及與RNAiMAX 在設定比下按照其方法復合的電泳迀移率檢測的結果圖。
[0029] 圖10為HepG2細胞中的Dex_R5H 5/microRNA復合體的細胞內定位檢測圖，顯示了 孵育6小時后，在N/P比為1、2和4的Dexl0k-R 5H5(40% )/miRNA149抑制劑復合體的制劑 和在預定比下按照RNAiMAX方法的RNAiMAX/miRNA149拮抗劑復合體的細胞的內在化。用 TM-羅丹明（紅色）染色miRNA，并用Hoechst 33342(藍色）染色細胞核。每個樣品測得 的焚光強度表不為總紅色焚光值/細胞。誤差棒表不4個重復的標準偏差。
[0030] 圖11為顯示用所示的制劑孵育48小時后的相對miRNA 149水平的柱狀圖，U6的 miRNAs用作內標，所有miRNA表達水平標準化為對照（無處理）。誤差棒表示4個重復的 標準偏差。*P〈〇. 05。
[0031]圖12為顯示用不同的藥物制劑（在N/P比為1、2和4下Dexl0-R5H5(40%)與 miRNA149抑制劑或miRNA NC的復合和在預定比下按照其方法RNAiMAX與miRNA149拮抗劑 或miRNA NC的復合）孵育24小時后的IfepG2細胞的細胞存活率的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0032] -般地，根據本發明的多種實施方式的用于核酸傳遞的新的組合物涉及一組具有 一個或多個含有陽離子肽的核酸傳遞側鏈的多糖聚合物。在某些實施方式中，這些陽離子 肽凝結并物理鍵合到核酸上以形成允許核酸傳遞并轉染進細胞內的多糖核酸復合體。在 某些實施方式中，本發明的多糖聚合物也可具有一個或多個兩性離子側鏈和/或反應性側 鏈。
[0033] 根據本發明的多種實施方式的用于核酸傳遞的多糖聚合物組合物含有多糖聚合 物鏈和一個或多個通過連接分子的方式將一個或多個陽離子肽鍵合到多糖聚合物鏈而形 成的核酸傳遞側鏈。多糖聚合物鏈（在此也指多糖聚合物主鏈或聚合物主鏈）是生物相 容的和可生物降解的。在某些實施方式中，這些多糖聚合物鏈可具有一