附著型慢病毒載體、制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種附著型慢病毒載體，以及該附著型慢病毒載體的制備方法及應 用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著對疾病分子機制認識的加深及生物技術的發展，基因治療已成為治療疾病的 一種新途徑，治療的疾病也從遺傳病擴展到感染性疾病、神經系統疾病以及腫瘤等。目前， 用于基因治療的載體系統可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。慢病毒載體是一種特殊 的逆轉錄病毒，與常用的逆轉錄病毒載體、腺病毒載體相比，不僅能感染分裂期細胞，還能 感染非分裂期細胞（如神經細胞、造血干細胞、肌纖維細胞和肝細胞等），并且具有容納大 片段外源性目的基因、不易誘發宿主免疫反應（免疫反應小、安全性好）等優點。慢病毒載 體在基因治療中具有廣泛的應用前景，已成為當前基因治療載體研究的熱點。
[0003] 典型的慢病毒載體系統為HIV-載體系統，由包裝成分和載體成分兩部分組成。包 裝成分由HIV-1基因組除去包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列構建，能夠反式提供 產生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的 HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。 [0004] 從慢病毒載體誕生至今，其安全性、滴度及轉導能力等均有較大改進。第一代慢病 毒載體系統以三質粒系統為代表，由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒3種質粒組成。包裝質 粒是HIV-1前病毒基因組5'端LTR由巨細胞病毒早期啟動子取代，3'端LTR由SV40 polyA 序列取代。包裝成分分別構建在兩個質粒上，一個表達gag和pol，另一個表達env。包膜 質粒采用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G)替代原病毒的env基因。載體質粒攜帶5' 端LTR和全部5'端非翻譯區域，另外還帶有rev應答元件（RRE)。第二代慢病毒載體系統 在第一代的基礎上作出改進，即在包裝質粒中刪除HIV的所有輔助基因（如vif、vpr、vpu 和nef基因），在增加載體安全性的同時不影響病毒的滴度和感染能力。第三代慢病毒載體 系統采用四質粒替代原有的三質粒系統，改進之處在于：1)將rev基因單獨放在一個包裝 質粒上；2)增加兩個安全特性，一是構建自身失活的慢病毒載體，刪除U3區的3' LTR，使載 體失去HIV-1增強子及啟動子序列，即存在所有病毒蛋白也不能轉錄出RNA，二是采用異源 啟動子序列替代tat基因，僅保留原始HIV-1基因組中的gag、pol和rev。因此，第三代慢 病毒載體系統更加安全、可靠。
[0005] 雖然慢病毒載體的安全性、滴度及轉導能力等均有所提高，但也存在以下問題，即 現有載體必須整合到宿主細胞染色體上，而載體的隨機整合會引起插入突變或導致轉基因 的沉默，嚴重影響載體在基因治療中的應用。公告號CN101532031B的發明專利公開了一種 非整合慢病毒載體系統，由PLVTH載體、pHelper1. 0載體和pCMV-VSV-G載體共同轉染宿主 細胞后，在宿主細胞中包裝獲得，其中pHelper1. 0載體為pCMV-dR8. 2dvpr載體中HIV整 合酶基因編碼的HIV整合酶第257~259位氨基酸由IKV突變為AAH獲得，該載體系統能 夠克服隨機整合的缺點，但其持久穩定表達時間較短，15天左右表達目的基因的細胞個數 較常規病毒減少70~80%。因此，構建高效安全的慢病毒載體是基因治療中亟待解決的問 題。
[0006] 核基質附著區（matrix attachment region，MAR)是指經限制酶消化后仍附著在 核基質上的DNA序列，長度為200~2000bp，具有典型的結構特點（沒有同源序列），如富 含AT堿基對（> 70% )，含有幾個短的"共有序列"和拓樸異構酶II結合位點。MAR序列在 哺乳動物細胞轉基因表達調控中起重要作用：1)提供順式作用元件，具有復制起始點和啟 動子功能；2)避免表觀沉默，提高載體的轉基因表達水平。然而，尚未有MAR序列用于介導 慢病毒載體附著存在的相關報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種附著型慢病毒載體，一方面介導外源基因在哺乳動物細 胞中穩定、高效、持久的表達，另一方面附著的、而非整合到靶細胞基因組中，安全性能好。
[0008] 同時，本發明還提供一種附著型慢病毒載體的制備方法。
[0009] 最后，本發明再提供一種附著型慢病毒載體的應用。
[0010] 為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：
[0011] 附著型慢病毒載體，由pLRZM載體與包裝系統共同轉染宿主細胞獲得，所述pLRZM 載體為pLVX-IRES-ZsGreenl載體（圖譜見圖1)中土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件 (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)替換為 人源性MAR序列或其95%以上同源序列所得。土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件序列如SEQ ID NO. 2 所示，也即 pLVX-IRES-ZsGreenl 載體序列（Cat. Nos. 632187)中第 4126 ~4717 位 堿基；人源性獻1?序列為661^&1^登錄號為1183137.1序列（如3￡〇10勵.3所示）中第 14~2161位堿基。
[0012] 所述宿主細胞為HEK293T細胞，包裝系統為pHelperl.O和pHelper2.0, pLRZM載 體在宿主細胞中包裝得到附著型慢病毒載體。
[0013] 上述附著型慢病毒載體的制備方法，步驟如下：
[0014] 1)分別采用PacI和Xmal雙酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreenl載體，回 收并連接，得到pLVX-IRES-ZsGreen2載體；
[0015] 2)以人外周血基因組DNA為模板，利用引物P1、P2擴增人源性MAR序列得擴增產 物A;
[0016] 3)分別采用PacI和Xmal雙酶切擴增產物A及pLVX-IRES-ZsGreen2載體，回收并 連接，得到pLRZM載體；
[0017] 4)采用pLRZM載體、包裝系統共同轉染宿主細胞，培養得到含附著型慢病毒載體 的細胞培養液，分離、純化得到附著型慢病毒載體。
[0018] 步驟1)中人工合成序列A的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 步驟2)中引物P1、P2為：
[0020] P1 :5，-CCGTTAATTTATCGCCACGCACAAGATC-3，，
[0021] P2 :5 ' -CAACCCGGGCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTATCA-3'，
[0022] 下劃線處為酶切位點，其中P1含有PacI酶切位點，P2含有Xmal酶切位點。
[0023] 步驟2)中擴增產物A的堿基序列與GenBank登錄號為M83137. 1的人源性MAR序 列一致（見SEQ ID NO. 3中第14~2161位堿基）。
[0024] 步驟4)中宿主細胞為HEK293T細胞，包裝系統為pHelperl. 0和pHelper2. 0。
[0025] 上述附著型慢病毒載體的應用，具體為：將外源基因插入附著型慢病毒載體的多 克隆酶切位點中，與包裝系統共同轉染宿主細胞，得到插入有外源基因的附著型慢病毒載 體，再轉染靶細胞，即可。
[0026] 所述宿主細胞為HEK293T細胞，包裝系統為pHelperl. 0和pHelper2. 0。插入有外 源基因的附著型慢病毒載體在宿主細胞中包裝成病毒顆粒后即可用于轉染靶細胞（如哺 乳動物細胞）。
[0027] 具體的，附著型慢病毒載體的應用，步驟如下：
[0028] 1)以人基因組DNA為模板，利用引物P3、P4擴增miR-145序列得擴增產物B ;
[0029] 2)分別采用Xhol和BamHI雙酶切擴增產物B及附著型慢病毒載體，回收并連接， 得到 pLRZM-miR145 載體；
[0030] 3)采用pLRZM-miR145載體、包裝系統共同轉染宿主細胞，培養后分離、純化得到 含miR-145序列的附著型慢病毒載體。
[0031] 步驟1)中所述引物P3、P4為：
[0032] P3 :5，-CCGCTCGAGGAATGGTTGGTTTAAATCCACCC-3，，
[0033] P4 :5 ' -CCGGGATCCCATGCCTGATGGTGTCCTG-3'，
[0034] 下劃線處為酶切位點，其中P3含有Xhol酶切位點，P4含有BamHI酶切位點。
[0035] 步驟1)中擴增產物B的堿基序列與Genbank登錄號為GQ292874. 1的人miR-145 前體序列一致（見SEQ ID NO. 6中第1357~2001位堿基）。
[0036] 步驟3)中宿主細胞為HEK293T細胞，包裝系統為pHelperl. 0和pHelper2. 0。
[0037] 本發明的有益效果：
[0038] 本發明中pLRZM載體含有核基質附著區序列，將該載體與包裝系統共同轉染宿主 細胞后，即在宿主細胞中包裝獲得附著型慢病毒載體。該附著型慢病毒載體附著于宿主細 胞染色體上，而非整合到宿主細胞染色體中，并且能夠介導外源基因在哺乳動物細胞中穩 定、尚效、持久的表達，可用于基因治療，具有廣闊的市場如景。
【附圖說明】