一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物轉基因技術領域，具體涉及一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉 化方法。
【背景技術】
[0002] 荻（Miscanthus saccharif lorus (Maxim) Benth.)為禾本科多年生水陸兩生的草 本植物。荻高1~1. 5m，直徑約5mm，具有10多個節和發達被鱗片的長匍匐根狀莖，原產于 東亞，目前在我國東北、華北、西北和華東地區均有分布。因具有再生能力強、適應性強和干 物質產量高等特點，被認為是一種重要的能源植物。而利用能源植物開展重金屬污染土壤 修復可以實現生物質原料生產與污染土壤治理的雙贏。
[0003]例如，公開號為CN101786097A的中國發明專利申請文獻公開了一種修復鎘鉛等 重金屬污染土壤的方法，技術方案是：在含污染物鎘鉛等金屬的土壤上種植荻，當荻長到成 熟期后，將荻整體從污染土壤上移走；在含污染物鎘鉛等重金屬的土壤上種植荻，采用露天 常規栽培，調節土壤水份和營養成分。
[0004][0005]然而，荻對于土壤修復還存在一定的局限性，例如，雖然荻對重金屬具有較強的耐 性，但由于其不能把較多的重金屬轉移到地上部，而不能有效的用于植物修復。建立荻轉基 因技術是一種很好的快速培育荻抗逆新品種的方法。例如，公開號為CN 102239808A的中 國發明專利申請文獻公開了荻的組織培養基及組培方法，組培方法經過如下五個步驟：一 是外植體的采集與消毒，二是初代培養，三是不定芽誘導，四是不定芽增殖培養，五是生根 誘導。并公開了分別用于初代培養、不定芽誘導、不定芽增值培養基生根誘導的4中培養 基。
[0006]由于轉化方法成熟、轉化效率高和操作簡單等優點，農桿菌轉化法已成為應用最 廣泛的植物轉化方法。然而，截止到目前，還沒有關于采用農桿菌介導荻愈傷組織轉基因技 術的報道。
【發明內容】
[0007]本發明提供了一種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法及應用，為通過轉基因 技術培育荻抗逆新品種奠定了基礎。
[0008] -種農桿菌介導的荻種子愈傷組織轉化方法，包括如下步驟：
[0009] (1)選取荻成熟種子，消毒、清洗后依次進行愈傷組織誘導、繼代培養；
[0010] (2)將繼代培養后的胚性愈傷組織置于含有農桿菌菌液的侵染液中侵染，所述農 桿菌菌液帶有表達載體；侵染后的胚性愈傷組織在共培養基上進行共培養；
[0011] (3)取共培養后的愈傷組織依次經無菌水和含羧卞青霉素的無菌水清洗，然后移 至含有羧卞青霉素和潮霉素的選擇培養基上進行篩選；
[0012] (4)將篩選得到的抗性愈傷組織移至分化培養基上，進行分化培養，誘導出不定 芽；
[0013] (5)將分化出的不定芽移至生根培養基上，培養成完整植株。
[0014] 荻成熟種子的消毒、清洗過程為：選取籽粒飽滿的荻種子，依次用75%的乙醇和 30%的次氯酸鈉消毒，消毒結束后用無菌水清洗種子。
[0015] 愈傷組織誘導過程為：將消毒的種子在無菌濾紙上晾干，接種到誘導培養基上，每 皿20顆左右，用封口膜封好培養皿，在28°C光照培養箱培養40天。
[0016] 繼代培養過程為：用鑷子挑選生長良好的胚性愈傷組織接種于繼代培養基上，在 28°C光照培養箱繼代培養15天。
[0017] 愈傷組織誘導和繼代培養基：MS培養基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8。
[0018] 優選地，所述農桿菌為EHA105;所述表達載體為pCAMBIA1300。pCAMBIA1300的物 理圖譜如圖1所示，該表達載體為空載體，載體上含有35S啟動子序列和hptll基因序列。
[0019] 進一步地，步驟（2)中所述含農桿菌菌液的侵染液由如下方法制備：
[0020] 挑取單個攜帶PCAMBIA1300載體的農桿菌菌落，接入到含有卡那霉素和鏈霉素的 YEP液體培養基中，26~30°C過夜培養，得到0D600為0. 8-1. 0的菌液；取培養好的菌液 離心收集菌體，用含乙酰丁香酮的侵染液重懸菌體，使重懸后的菌液0D600達到0. 015~ 0. 025,即得所述含農桿菌菌液的侵染液。
[0021] 更進一步，挑取單個攜帶PCAMBIA1300載體的農桿菌菌落，接入到含有50mg/L卡 那霉素和50mg/L鏈霉素的YEP液體培養基中，28°C過夜培養，得到0D600為0. 8-1. 0的菌 液；取培養好的菌液lml離心收集菌液，用含200 y M乙酰丁香酮的侵染液重懸菌液，使重懸 后的菌液0D600達到0.02,即得步驟（2)中所述含農桿菌菌液的侵染液。
[0022] 其中，含200 y M乙酰丁香酮的侵染液的組成為：MS培養基+lmg/L煙酸+lmg/L鹽 酸吡哆醇+l〇mg/L鹽酸硫脘素+0. lg/L肌醇+3. 9g/L 2- (N-嗎啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解 酪蛋白；蔗糖30g/L ;pH 5. 5;高壓滅菌冷卻至55°C時加入乙酰丁香酮至終濃度為200 yM。
[0023] YEP液體培養基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化鈉。
[0024] 優選地，步驟（2)中在侵染液中侵染的時間為5-10min。
[0025] 步驟（2)中共侵染時的振蕩速度為80rpm。
[0026] 優選地，共培養培養基為：MS培養基+lmg/L煙酸+lmg/L鹽酸吡哆醇+10mg/L鹽 酸硫脘素+〇. lg/L肌醇+3. 9g/L 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8 ;高壓滅菌冷卻至55°C時加入乙酰丁香酮至終濃度為 200 y M〇
[0027] 共培養時的培養條件為：將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；將 愈傷組織置于有一張無菌濾紙的共培養基上，24~26 °C (優選25 °C )暗培養2~4 (優選 3)天。
[0028] 優選地，步驟（3)中在利用選擇培養基進行兩輪篩選。
[0029] 進一步優選地，選擇培養基：MS培養基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8 ;第一 輪篩選的選擇培養基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二輪篩選 的選擇培養基在高壓滅菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。
[0030] 更進一步優選地，每輪篩選的周期為20天。
[0031] 選擇培養前先用無菌水清洗5-6次，再用含300mg/L的羧卞青霉素的無菌水清洗 2遍；然后在無菌濾紙上晾干。
[0032] 優選地，分化培養條件：將選擇培養后的抗性愈傷移至分化培養基上，放入恒溫 (25±1°C )培養室中，光照時間16小時，光照強度為12001x，相對濕度為60±2%，培養40 天后可誘導出不定芽。
[0033] 分化培養基：MS培養基+0? 5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0? 05mg/L萘乙酸；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝膠4g/L ;pH 5. 8。
[0034] 優選地，生根培養條件：將分化出來的不定芽分成的單株接種到生根培養基上，放 入恒溫（25±1°C )培養室中，光照時間16小時，光照強度為12001x，相對濕度為60±2%， 10天后形成完整植株。
[0035] 生根培養基：1/2MS培養基+0? 4mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L ;Phytagel植物凝膠4g/ L ；pH 5. 8〇
[0036] 對獲得的完整植株進行陽性苗PCR檢測：將獲得的所得的轉35S啟動子和hpt基 因的植株進行PCR檢測。
[0037] 陽性苗PCR檢測方法是：用CTAB法提取T。代轉基因荻株系的基因組DNA，以35S 啟動子序列為模板設計引物，擴增得到238bp(SEQ ID N0:1)片段，引物序列如下：
[0038]正向引物35SU:5' -TCCATCTTTGGGACCACTGT-3'（SEQ ID N0 :3)
[0039]反向引物35SL:5' -CGACACTCTCGTCTACTCCA-3'（SEQ ID NO :4)
[0040] 以hptll基因序列為模板設計引物，擴增得到373bp(SEQ ID NO :2)片段，引物序 列如下：
[0041]正向引物hptU:5' -GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATC-3'（SEQ ID N0 :5)
[0042]反向引物hptL:5' -CATAACAGCGGTCATTGACTGGAGC-3'（SEQ ID NO :6)。
[0043] 本發明的方法用于培育荻轉基因植株。為通過轉基因技術培育荻抗逆新品種奠定 了基礎。
[0044] 本發明的有益效果：
[0045] 1、本發明在國內外首次利用農桿菌介導荻成熟種子愈傷組織轉化獲得轉基因植 株，為今后荻的遺傳改良培育抗逆種質資源提供了新的技術平臺。利用農桿菌介導荻成 熟種子愈傷組織轉化獲得轉基因植株相對于其他傳統方法，具有費用低、拷貝數低、重復性 好、基因沉默現象少、轉育周期短及能轉化較大片段等獨特優點。
[0046] 2、本發明的受體材料易于獲得，實驗不受季節限制。在種子成熟期，可收集大量的 種子于4°C保存油種子誘導出的胚性愈傷，增值率高。
[0047] 3、本發明從種子誘導胚性愈傷到獲得完整轉基因植株需要5個月，操作方便，再 生率高達30. 2%。
[0048] 4、荻為單子葉植物，本發明通過誘導愈傷進行侵染，優化得到誘導荻愈傷的培養 基，采用農桿菌侵染愈傷組織，大大的提高了轉化效率。
【附圖說明】
[0049] 圖1是本發明應用的表達載體PCAMBIA1300的物理圖譜。
[0050] 圖2 :是本發明實施例中米用荻成熟種子誘導的胚性愈傷。
[0051]圖3是本發明實施例中胚性愈傷的不同狀態：圖3A在第一輪選擇培養基上的抗性 愈傷；圖3B在第二輪選擇培養基上的抗性愈傷；圖3C是抗性愈傷分化20天后的狀態；圖 3D是抗性愈傷分化30天后的狀態；圖3E是分化出的植株不定芽增殖的狀態；圖3F是不定 芽生根的狀態。
[0052] 圖4是T0代植株35S啟動子PCR鑒定示意圖。
[0053] 圖5是T0代植株hptll基因PCR鑒定示意圖。
【具體實施方式】
[0054] 為了進一步闡明本發明，以下結合實例加以說明。
[0055] 實施例1荻成熟種子胚性愈傷的誘導和繼代
[0056] 1)種子的收集：荻的成熟種子于2013年11月采于浙江臨安大明山景區，采回后 連帶花序烘干置于4°C保存。
[0057] 2)種子的消毒：將荻種子的外殼剝去，選取健壯成熟的種子裝入1. 5mL離心管中 進行消毒處理。過程如下：向裝有種子的離心管中加入lmL75%的乙醇，上下顛倒試管30s 后倒掉酒