一種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物轉基因技術領域，具體是一種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材 料的方法。
【背景技術】
[0002] 蓖麻是一種用途很廣、經濟效益很大的非食用油料作物。蓖麻種子用于榨油，種 子含油量在50%左右，蓖麻油及其深加工后產品的用途非常廣泛，已經涉及到生產生活的 各個方面，因此，對蓖麻油的生物合成過程進行深入的研究，努力提高種子中蓖麻油（即粗 脂肪）含量具有非常顯著的經濟價值。蓖麻油的主要成分為高級脂肪酸的甘油三酸酯，蓖 麻油中有8種脂肪酸，棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生一烯酸和蓖麻油 酸。蓖麻油酸是蓖麻粗脂肪的主要成分，也是蓖麻油重要產品-癸二酸的原料。
[0003] 在中國，由于蓖麻產量低、收購價格低，導致蓖麻種植面積大量萎縮，蓖麻種子供 不應求，所以蓖麻的首要育種目標一直是高產，只是在最近幾年才開始注重其品質，即含油 率，但是也只是以百粒重、種仁率、種仁中粗脂肪含量為指標的較多，少數品種提到粗脂肪 中蓖麻油酸的含量，這種評價不夠直觀。
[0004] 在國外，蓖麻油生物合成的相關研究起步較早。關于蓖麻油的生物合成過程，目前 已逐漸被Jiann-Tsyh Lin等人研究清楚，對蓖麻油的生物合成過程及其所涉及的關鍵酶的 研究相對較多，主要集中在油酰基-12-羥基化酶（leoyl-12-hydroxylase)，該酶催化2-油 酰基卵磷脂（2-oleoyl-PC)形成2-蓖麻油酰基-卵磷脂（2-Ricinoleoyl-PC)，也有報道通 過基因工程手段將該酶的基因轉到其他植物中來驗證酶功能的研究。尚未見通過轉基因的 方式獲得蓖麻油含量提高的蓖麻新材料的研究。
[0005] 磷脂酶C基因，也是功能基因，是蓖麻油生物合成過程中的關鍵酶的基因。磷脂酶 C在蓖麻油生物合成過程中催化2-油酰基卵磷脂（2-oleoyl-PC)形成1-酰基-2-油酰基 甘油（l-Acyl-2-oleoyl-sn-glycerol)，該酶被抑制后，可阻止非羥基脂肪酸進入三酰基甘 油，從而增加種子中蓖麻油酸的含量。但是，目前尚未見使蓖麻內源的磷脂酶C基因沉默， 提高種子內蓖麻油酸含量，從而提高蓖麻種子中蓖麻油含量的報道。
[0006] 與本發明相關的現有技術一：關于蓖麻轉基因方面的研究，國外只有兩例成功報 道，Sujatha等于2005年首次報道用農桿菌介導法獲得了轉結構基因的蓖麻植株，Malathi 等于2006年報道獲得了轉功能基因，即抗蟲基因的蓖麻植株。國內，有3例進行蓖麻功能 基因的克隆和載體構建研究。高穎等克隆了蓖麻抗鹽堿基因PAL ;黃鳳蘭等和陳永勝等分 別克隆了毒蛋白A鏈基因，并構建了用于共抑制的重復表達載體和用于RNAi的表達載體， 并對蓖麻進行了遺傳轉化；劉鵬等克隆了蓖麻矮化相關基因一一細胞色素P450基因，構建 了該基因的RNAi表達載體，并對蓖麻進行了遺傳轉化。
[0007] 現有技術一的缺點：國外兩例蓖麻轉基因成功的案例，都是使得外源基因（所轉 的基因）在蓖麻這一植物體內表達，并且所轉的基因一個是結構基因，另一個為抗蟲基因。 國內進行蓖麻基因克隆和載體構建的研究，涉及的是功能基因，包括蓖麻抗鹽堿基因PAL 斜體、毒蛋白A鏈基因、矮化相關基因P450。目前，尚未見通過轉基因的方式獲得蓖麻油酸 含量提高的蓖麻新材料的研究。
[0008] 與本發明相關的現有技術二：由于蓖麻育種的首要目標一直是高產，對品種的品 質即含油量的研究一直被重視得不夠。在蓖麻品種審定時，多數品種以畝產、百粒重、種仁 率、種仁中粗脂肪含量為指標的較多，少數品種提到粗脂肪中蓖麻油酸的含量。在作物常規 育種中，通常通過單株選擇的方式獲得綜合性狀良好的材料，再利用這樣的材料進行雜優 利用。在蓖麻的雜優利用過程中，首先注重的是產量性狀，通常選擇高產性狀好、配合力良 好，并且含油量高的材料，再利用這樣的材料進行雜優利用獲得新品種。
[0009] 現有技術二的缺點：該技術對提高種子中蓖麻油含量的速度較慢，效果是逐漸才 能表現出來的。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于提供一種針對性強、效果顯著的獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻 新材料的方法，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0011] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0012] -種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具體步驟如下：
[0013] (1)分離磷脂酶C基因的兩個片段；
[0014] (2)構建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表達載體；
[0015] (3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表達載體轉化農桿菌；
[0016] (4)用農桿菌介導法對蓖麻子葉節進行遺傳轉化，獲得轉基因抗性植株；
[0017] (5)對轉基因抗性植株進行檢測。
[0018] 作為本發明進一步的方案：所述步驟（1)中分離磷脂酶C基因的兩個片段的方法， 具體步驟如下：
[0019] 1)用試劑盒法提取蓖麻種子中的總RNA ;
[0020] 2)用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA;
[0021] 3)用Primer-premier5. 0軟件設計引物：據NCBI中發布的蓖麻磷脂酶C基因 的mRNA序列號XM_002511121. 1，利用Primer-premier5. 0軟件設計兩對引物，分別命名 為CIS與C1X、C2S與C2X，應用DNAMAN軟件分析基因序列內部的限制性酶切位點，并根據 pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121質粒上的多克隆位點的情況，以及引物前端 加酶切位點和保護堿基的原則，設計各條引物序列；
[0022] 4)用降落PCR的方法分離磷脂酶C基因的兩個特異性片段；
[0023]5)用膠回收試劑盒回收特異性片段；
[0024] 6) Cl、C2特異性片段分別與pMD18-T-Simple-Vector克隆載體連接；
[0025] 7)連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞；
[0026] 8)用PCR和酶切的方法篩選大腸桿菌陽性克隆；
[0027] 9)大腸桿菌陽性克隆提交生物公司進行序列測序：測序結果表明蓖麻磷脂酶C基 因的Cl、C2片段堿基長度分別是803bp、458bp。
[0028] 作為本發明進一步的方案：所述步驟（2)中用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成 cDNA的方法，具體步驟如下：
[0029] 1)用限制性內切酶和膠回收試劑盒從克隆載體上分別酶切、回收磷脂酶C基因兩 個特異性片段；
[0030] 2)用限制性內切酶將內含子從pHANNIBAL載體上切下，用膠回收試劑盒回收；
[0031] 3)用限制性內切酶將植物表達載體質粒pBI-121線性化；
[0032] 4)用連接酶將磷脂酶C基因的兩個特異性片段、內含子和pBI-121連接在一起；
[0033] 5)連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞；
[0034] 6)用PCR和酶切的方法篩選大腸桿菌陽性克隆：設計的引物上游在pBI-121的 35S啟動子上，下游則在內含子和C1片段上，引物分別命名為NS1和NX1、C1S1和C1X1;
[0035] 7)大腸桿菌陽性克隆提交生物公司進行序列測序：經測序，證明所構建的含有磷 脂酶C基因的RNAi植物表達載體pBI-Cl-IN-C2結構正確。
[0036] 作為本發明再進一步的方案：所述步驟（4)獲得轉基因抗性植株的方法，具體步 驟如下：
[0037] 1)蓖麻子葉節預培養；
[0038] 2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表達載體質粒的農桿菌浸染蓖麻子葉節；
[0039] 3)農桿菌與子葉節共培養；
[0040] 4)用除菌劑除去子葉節上的農桿菌；
[0041] 5)用卡那霉素對子葉節進行抗性篩選；
[0042] 6)轉基因抗性苗進行馴化移栽，得到轉基因抗性植株的種子。
[0043] 作為本發明再進一步的方案：所述步驟（5)中對轉基因抗性植株進行檢測的方 法，具體步驟如下：
[0044]1)分子檢測包括：DNA水平對轉基因抗性植株葉片采用PCR檢測，RNA水平對種子 采用熒光定量PCR檢測，蛋白質水平對種子采用Western-Blot檢測；
[0045]2)生物學檢測：測定轉基因抗性植株和對照非轉基因植株種子中蓖麻油酸含量 和總蓖麻油含量，步驟包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲 醇溶液進行甲酯化；利用氣相色譜_質譜-計算機聯用技術分離、鑒定蓖麻油酸含量和總蓖 麻油含量。
[0046] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0047] 本發明通過RNAi技術，沉默蓖麻油生物合成過程中的關鍵酶基因-磷脂酶C基因 的表達，阻止非羥基脂肪酸進入三酰基甘油，增加種子中蓖麻油酸含量，針對性強，從而進 一步提高蓖麻種子中蓖麻油含量。提高蓖麻種子中蓖麻油含量的速度快，效果顯著，種子 中粗脂肪含量為53. 61-56. 15%，提高了 2.54%;蓖麻油酸含量為46. 33-49. 31%，提高了 2. 98%〇
【附圖說明】
[0048] 圖1為本發明中磷脂酶C基因RNAi表達載體的構建示意圖。
[0049] 圖2為本發明中從蓖麻種子中提取蓖麻總RNA的結果示意圖。
[0050] 圖3為本發明中mRNA逆轉錄成cDNA的電泳檢測結果示意圖。
[0051] 圖4為本發明中蓖麻磷脂酶C基因的片段Cl、C2的PCR擴增結果示意圖。
[0052] 圖5為本發明中重組質粒pMD-Cl的PCR結果示意圖。
[0053] 圖6為本發明中重組質粒pMD-Cl的Xbal、Kpnl雙酶切結果示意圖。
[0054] 圖7為本發明中重組質粒pMD-C2的PCR結果示意圖。
[0055] 圖8為本發明中重組質粒pMD-C2的SmaI、HindIII雙酶切結果示意圖。
[0056] 圖9為本發明中用EcoRI、HindIII將內含子從pHANNIBAL上酶切的結果示意圖。
[0057] 圖10為本發明中用SmaI、XbaI對表達載體pBI-121雙酶切的結果示意圖。
[0058] 圖11為本發明中RNAi表達載體pBI-Cl-IN-C2的PCR檢測結果示意圖。
[0059] 圖12為本發明中RNAi表達載體pBI-Cl-IN-C2酶切檢測結果示意圖。
[0060] 圖13為本發明中RNAi表達載體pBI-Cl-IN-C2轉化農桿菌后的PCR鑒定結果示 意圖。
[0061] 圖14為本發明中分子檢測時DNA水平對轉基因抗性植株葉片采用PCR檢測示意 圖。
[0062] 圖15為本發明中分子檢測時RNA水平對種子采用熒光定量PCR檢測示意圖。
[0063] 圖16為本發明中分子檢測時蛋白質水平對種子采用Western-Blot檢測示意圖。
【具體實施方式】
[0064] 下面結合【具體實施方式】對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。
[0065] 請參閱圖1-16, 一種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具體步驟如 下：
[0066] (1)分離磷脂酶C基因的兩個片段：
[0067]1)用試劑盒法提取蓖麻種子中的總RNA :所用蓖麻材料為2129品系，從2129品系 種子中提取蓖麻總RNA的結果見圖2 ;
[0068] 2)用逆轉