溶栓酶基因qk-02的表達方法及專用表達載體和工程菌的制作方法
【專利說明】溶栓酶基因QK-02的表達方法及專用表達載體和工程菌 【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體的是指一種溶栓酶基因QK-02的表達方法及專用 表達載體和工程菌。 【【背景技術】】
[0002] 由于遺傳背景較清楚，大腸桿菌作為基因克隆受體的首選菌株已被廣泛應用于基 因工程中，并取得了許多重大成果。大腸桿菌表達具有以下優勢：目標基因表達水平高；表 達系統成熟完善；易于培養（培養方法簡單、生長快、培養周期短、抗污染能力強）、成本低； 被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。然而，其表達也有一些缺點，如缺乏翻譯后加 工修飾，易形成包涵體蛋白，不利于后續的操作等。
[0003] 枯草桿菌溶栓酶（Bacillus subtilis QK02,保存序列號：CCTCC NO :M203078)是 通過檢測降解纖維蛋白能力的方法篩選到的，研究表明，該酶具有較強的纖溶活性，可產生 大量的溶栓酶QK，是一種潛在的溶栓藥物，它不僅具有良好的溶栓效果，而且可經口服達到 纖溶目的，其特性優于當前臨床應用的溶栓藥物，如鏈激酶、尿激酶等。發明人還發現該酶 在體內外及血管內皮細胞中具有拮抗由血紅素、NaNOjP H 202帶來的損傷的能力。目前，該 酶主要來源于野生枯草芽孢桿菌發酵的納豆、豆豉等，但是納豆、豆豉的風味還不能被許多 人所習慣和接受，從發酵液中分離純化枯草桿菌溶栓酶通常產量較低、生產成本高，這些因 素都在一定程度上限制了枯草桿菌溶栓酶的開發和應用。 【
【發明內容】
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[0004] 有鑒于此，為克服現有技術的不足，本發明提供一種溶栓酶基因QK-02的表達方 法及專用表達載體和工程菌。
[0005] 為實現上述目的，本發明所提供的溶栓酶基因QK-02的專用表達載體，所述載體 在細胞周質中高水平表達重組蛋白，引導重組蛋白分泌到培養基中，其特征在于：所述載體 由pET40b表達載體和溶栓酶基因經過Sal I/EcoR I酶切后重組而成；所述載體基于T7啟 動子通過添加lac操縱子改造成為IPTG誘導的啟動子；所述載體具有His標簽、腸激酶酶 切位點，具有卡那霉素抗性，可表達出DsbC(二硫鍵異構酶）融合蛋白。
[0006] 作為優選方案，所述載體中含有DsbC融合蛋白。
[0007] 進一步地，本發明還提供一種用于表達枯草桿菌溶栓酶的工程菌，是將上述枯草 桿菌溶栓酶的專用表達載體導入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中得到的重組菌。可采用生 物工程領域中常用的方法，例如CacV法、電穿孔轉化法、原生質體轉化法等將所構建的重 組表達載體導入BL21 (DE3)感受態細胞中。
[0008] 本發明還提供一種溶栓酶基因QK-02的表達方法，是發酵上述工程菌，經誘導后， 再對發酵產物通過腸激酶酶切及鎳柱的分離純化得到qk-02。
[0009] 進一步地，它包括如下步驟：
[0010] (1)從枯草桿菌Bacillus sutilisQK-02中提取基因組DNA，并利用PCR擴增得到 DNA片段（即qk基因）；
[0011] (2)將qk基因克隆到表達載體pET40b中，然后轉化到克隆菌株DH5a感受態中， 篩選陽性克隆DH5a -qk ;
[0012] (3)將陽性重組克隆DH5a-qk轉化到表達菌株BL21(DE3)感受態細胞中，并用 IPTG誘導表達重組蛋白酶，SDS-PAGE及Western blot法檢測蛋白大小，BCA方法檢測蛋白 濃度；
[0013] (4)重組蛋白的分離純化：用腸激酶酶切，His標簽鎳柱及透析濃縮純化的方法得 到較純的重組蛋白qk，SDS-PAGE檢測；
[0014] (5)誘導表達條件的優化：加入IPTG，所加入IPTG的濃度為0.1-lmM，誘導溫度為 16-37°C，誘導時間為3-16小時；并進行Western及SDS-PAGE的檢測。
[0015] 進一步地，所述步驟（5)中加入IPTG的濃度為0? 5mM，誘導溫度為22°C，誘導時間 為12小時。
[0016] 本發明所提供的枯草桿菌溶栓酶的表達方法，是誘導表達上述枯草桿菌溶栓酶的 專用表達工程菌，再通過腸激酶酶切，分離純化得到枯草桿菌溶栓酶。
[0017] 本發明的優點在于：本發明的用于表達枯草桿菌溶栓酶的載體，是新的載體 pET40b允許在細胞周質中高水平表達重組蛋白。這種表達系統不同于傳統的原核表達，能 正確折疊二硫鍵，不需要復性就可以得到具有活性的多肽，相對而言簡單有效，減少了樣本 在分離純化、復性等過程中的損耗以及獲得正確活性蛋白的不確定性。本發明的表達載體， 高活性，抗氧化，無致病性，高分泌特性，可以直接將功能性胞外蛋白酶分泌到細胞周質中， 大大增加了融合蛋白的可溶性，提高了蛋白的活性，避免了包涵體溶解及復性帶來的麻煩， 成本低。因此，該酶在心血管疾病治病中有重要的應用價值。 【【附圖說明】】
[0018] 圖1為枯草桿菌溶栓酶誘導型表達載體pET40b(+)示意圖。
[0019] 圖2為枯草桿菌溶栓酶PCR后結果圖。圖中：M:Marker 1、2均為QK-02DNA樣品。
[0020] 圖3為pET40b的酶切鑒定結果。圖中：M:Marker 1為沒有酶切的載體片段，2為 雙酶切后結果。
[0021] 圖4為枯草桿菌溶栓酶在大腸桿菌中誘導表達的Western結果。
[0022] 圖5為枯草桿菌溶栓酶在大腸桿菌中誘導型表達產物酶切后的SDS-PAGE檢測結 果。
[0023]圖6為分泌表達的枯草桿菌溶栓酶的蛋白平板活性檢測結果。
[0024] 圖7為檢測溫度、誘導時間和IPTG濃度對枯草桿菌溶栓酶誘導分泌表達影響的結 果。
[0025] 表1為枯草桿菌溶栓酶QK-2純化結果。 【【具體實施方式】】
[0026] 下面結合附圖和具體實例對本發明進行詳細的說明。
[0027] 實施例一：枯草桿菌QK-02的制備過程
[0028] (1)取水稻葉85°C熱處理10分鐘，用其包裹滅過菌的大豆，42°C培養24小時，后 用培養液浸泡培養過的大豆，將浸泡過大豆的培養液作10 2~10 6稀釋，涂布營養瓊脂平 板，37°c倒置培養后在平板上長出菌落。
[0029]所獲的菌落分別接種在5ml培養液中37 °C，250rpm培養24h后，6000rpm離心 5min。取20ul上清液在纖維蛋白平板上測定溶栓酶活性，然后選擇酶活性最高的菌株。
[0030] 實施例二：編碼溶栓酶QK的基因qk的PCR擴增和克隆及序列測定
[0031] 枯草桿菌Bacillus Subtilis QK-02的基因組DNA提取按照常規方法（Saito， H.et al，1963, Biochim.Biophys. Acta 72:619-629)來進行。
[0032] PCR擴增的引物設計：
[0033] 引物 P1 :5 ' ACGCGTCGACATGGCGCAATCTGTTCCTTACGGC
[0034] 引物 P2 :3 ' CCGGAATTCTAGCTATTATTGTGCAGCTGC
[0035] 擴增出的片段大小為828bp
[0036] PCR擴增反應體系50ul體系中：5ul枯草桿菌基因組DNA作為模板，引物P1、 P2(10uM)各 lul，10XPCR 緩沖液 5ul，dNTP(2mmol)5ul，K0D 酶 0? 5ul，其余用無菌水補足。 反應程序為：94￡€51^11，941€3〇8,56°(：1〇8,74 1€3〇8,35個循環，741€6111111。擴增產物在 1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測。結果見圖2。
[0037] 擴增產物和pET40b載體（圖譜見圖1)都經Sal I，EcoR I雙酶切，膠回收后16°C 連接過夜，〇&(：12法轉化到DH5 a細胞中，轉化產物涂布到含有卡那（Kan)抗生素的LB瓊脂 平板上，篩選重組子，37°C培養14-16h，挑選陽性克隆，提質粒雙酶切鑒定（結果見圖3)，并 送測序。
[0038] 實施例三：重組表達質粒qk的誘導表達
[0039] (1)將克隆后的重組質粒pET40b用鈣轉的方法轉化入大腸桿菌表達菌株 BL21 (DE3)感受態細胞中，涂布平板，篩選陽性重組子并鑒定。
[0040] (2)表達載體pET40b受T7啟動子控制，用該載體構建的表達質粒在不同溫度下 IPTG誘導表達。挑取單個陽性菌落接種于2mlLB培養基中，置搖床37°C過夜活化，然后以1: 50的比例稀釋到新鮮LB培養基中，37°C培養至A600 = 0.8~1.0,加入不同濃度的IPTG， 分別誘導不同時間梯度，在3h，5h，7h，12h后分別離心收集菌體，用1 XPBS溶解，超聲波破 碎，4°C離心取上清，Western檢測蛋白表達（條帶見圖4)，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。
[0041] (3)采用纖維蛋白平板法估測枯草桿菌溶栓酶活性。將2ml纖維蛋白原溶液 (50mg/ml)加入40ml瓊脂糖溶液（0. 75% )中，混勻后取8m