一種利用蛋白ihf構建克隆載體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種利用蛋白IHF構建克隆載體的方法，尤 其涉及一種利用含有和DNA雙鏈結合的蛋白IHF取代重組酶，在大腸桿菌中連接DNA片段 和克隆載體構建的新方法。
【背景技術】
[0002] DNA克隆是分子生物學的重要內容。傳統DNA克隆方法利用T4DNA連接酶 (T4DNALigase)的方法將待克隆的目的基因與載體連接，將該重組子轉化到受體菌中，篩選 鑒定正確的克隆。但是該方法涉及的步驟多，并且繁瑣費時，而且特定基因的克隆常因兩 端缺乏合適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。同源重組是指發 生在同一染色體等染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合，同源重 組需要一系列的蛋白質催化，如原核生物細胞內的RecA、RecF等，以及真核生物細胞內的 Rad51、Mrell_Rad50等等，同源重組反應通常根據交叉分子或holiday結構（Hoi的形成和 拆分分為三個階段，即前聯會體階段、聯會體形成和Holiday結構的拆分）。同源重組反應 嚴格依賴DNA分子之間的同源性。
[0003] 近年來PCR同源重組克隆法被愈來愈受重視，該方法不受載體和目的片段的酶切 位點限制，通過重組酶直接運用同源重組的方法完成目的片段與載體相連接的基因克隆技 術。該技術操作簡單，PCR產物一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應時間短和傳 統方法相比，具有快速，效率高的特點，但是重組酶純化的過程比較復雜，在運送和保存方 法要求也比較高。
[0004] IHF是與雙鏈DNA結合的類似組蛋白的耐熱的小分子蛋白質，IHF由a亞基（himA 編碼，11. 35kD)和亞基（hip編碼，10. 65kD)構成，A噬菌體的位置特異性重組需要宿 主編碼的整合宿主因子IHF。同源重組克隆法是利用重組酶來進行連接DNA和克隆的，迄今 為止國內國外，沒有任何有關利用同DNA (單鏈，雙鏈，或者是非特異性）結合的蛋白代替克 隆所需要的酶在大腸桿菌中進行定向克隆載體構建的報道。這種利用和DNA雙鏈結合蛋白 來克隆的方法屬于首創。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種利用蛋白IHF構建克隆載體的方法，具體為利用雙鏈 結合功能的整合宿主因子IHF來連接DNA片段和克隆載體構建的方法，該方法是通過引物 設計DNA片段之間的同源同組序列，用PCR技術把DNA片段擴增后，利用與DNA雙鏈結合功 能的整合宿主因子IHF取代重組酶的功能，并在大腸桿菌里DNA連接的過程。
[0006] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0007] -種利用蛋白IHF構建克隆載體的方法，具體通過以下步驟完成：
[0008] 1)對至少兩個待連接的DNA片段設計引物；
[0009] 2)根據酶切或者PCR反應得到待連接的線性化載體；
[0010] 3)對至少兩個待連接的DNA片段之間引入DNA同源同組序列；
[0011] 4)利用IHF蛋白進行同源重組轉化；
[0012] 5)在大腸桿菌中進行轉化和克隆，得到重組DNA質粒。
[0013] 進一步，步驟（1)所述的待連接的DNA片段包含用于克隆的線性化質粒片段。
[0014] 進一步，步驟（3)的具體步驟為根據限制性酶切或PCR反應得到待連接的線性化 載體的兩端序列，通過PCR反應得到與線性化載體的5'和3'末端具有15到50同源堿基 的目的DNA片段。
[0015] 進一步，步驟（4)中反應條件是將待連的DNA片段、Shift buffer、IHF蛋白混合 成10ul體系，混勻后離心，常溫反應10分鐘；Shift buffer的配方：25mM Tris PH8. 0和 10mM MgCl2。
[0016] 進一步，步驟（5)使用DH5 a或top 10或DH10B感受態細胞進行轉化。
[0017] 本發明的有益效果為：本技術操作簡單，PCR產物一步定向克隆，目的片段與載體 同源重組連接，常溫反應時間短至10分鐘，陽性率高達95%以上。
【附圖說明】
[0018] 圖1是IHFSDS-PAGE電泳檢測圖；
[0019] 圖2是IHF-P蛋白條帶迀移活性檢測。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。 [0021 ] 實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。
[0022] 實施例1
[0023] 1)IHF蛋白的制備
[0024] 將來源于大腸桿菌的IHFa或IHF0亞基或者是IHFa和IHF0的二聚體分別插 入PET22表達載體中，通過連接轉化并用菌落PCR、酶切鑒定及測序驗證，即可得到重組表 達載體pET22-IHFa或者pET22-IHF0或者是IHFa和IHF0的二聚體；
[0025] 將構建好的重組載體pET22_IHFa或者PET22-IHF0或者是IHFa和IHF0的二 聚體轉化大腸桿菌BL21，取含重組質粒的陽性菌株加入LB液體培養基中培養過夜，之后菌 液按1 %比例接種到50ml的LB培養液中，放入37°C搖床培養至其0D值為0. 6~0. 8 ;加 入IPTG，將菌液放入37°C搖床中誘導表達3小時；
[0026] 取誘導表達后的菌液離心得到菌體，裂解，釋放蛋白質。SDS-PAGE電泳檢測蛋白表 達情況如圖1所示。
[0027] 2)HF-P蛋白條帶迀移活性檢測
[0028] 將不同濃度的IHF-0蛋白加入到相同量的pET-22b質粒中，室溫放置lOmin后用 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，發現由加入低濃度蛋白到高濃度蛋白后，pET-22b質 粒的條帶發生了明顯的移動。
[0029] 實施例2
[0030] 本Shift實驗是用來測定IHF與DNA結合活性。將質粒pET-22b(5439bp，97ng/ ul)加入IHF進行shift實驗具體過程如下：
[0031] 瓊脂糖凝膠阻滯實驗（shift實驗），如表1所示確定好梯度，將質粒pET_22b與 shift buffer、IHF 102ng/ul蛋白混合成10ul體系。混勾后離心，室溫放置10分鐘。
[0032] 表 1 pET_22b 與 shift buffer、IHF 102ng/ul 混合體系
[0033]
[0034] 反應完成后，加入2ul DNA6Xloading buffer混勾，使用1%瓊脂糖凝膠進行電 泳，上樣量為5ul。實驗結果表明IHF蛋白具有和DNA結。
[0035] 實施例3
[0036] 本實施例是在待連接的DNA片段中加入不同濃度（IHF-P )蛋白后，在大腸桿菌中 轉化和克隆的結果（菌落生長情況），以及市場上購買的同源重組試劑盒的菌落生長情況。 克隆的效率用傳統的克隆PCR法來驗證。轉化和克隆具體過程：
[0037] 克隆載體構建過程（以線性載體pUC19和DNA片段A重組質粒為例）；pUC19線性 載體的DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，DNA片段A的序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0038] 1.線性載體準備
[0039] 1. 1?對PUC19質粒進行PCR擴增
[0040] 1. 1. 1PCR體系（100ul 體系）為：PUC19(2ng\ul)3ul，引物 l(pucl9-正引物）0? 5u， 引物 2(pucl9-反引物）0.5ul，2XMaster Mix 50ul，ddh2046ul〇
[0041 ] 引物1 (pucl9_正引物）的DNA序列：ctctagagtcgacc