一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因及其醫用用圖
【技術領域】
[0001] 本發明提供了一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因，此外，本發明還涉及利用該 診斷基因蛋白制備單克隆抗體和多克隆抗體，可用于建立犬細粒棘球絳蟲糞抗原的檢測方 法，進一步講是提供了用于犬的細粒棘球絳蟲ELISA檢測的蛋白基因，并應用于犬細粒棘 球絳蟲雙抗夾心ELISA方法的建立中，屬于犬科動物疾病檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 犬細粒棘球絳蟲病是細粒棘球絳蟲成蟲寄生于犬的 小腸內，使患犬食欲減退、消化紊亂，導致消化系統遭受嚴重損傷的一種寄生蟲病。其蟲卵 或者節片可隨犬糞排出體外，感染牛、羊、豬等動物以及人。至今，犬細粒棘球絳蟲病已在世 界范圍內流行，尤其是牧業國家。已嚴重威脅人類健康和畜牧業的快速發展，給世界經濟造 成了嚴重的損失。犬是細粒棘球絳蟲的主要終末宿主，也是細粒棘球蝴病的重要傳染源。因 此對犬感染該蟲情況的動態監測、診斷并及時治療對預防和徹底根除細粒棘球絳蟲病具有 重大的意義。目前，細粒棘球絳蟲成蟲診斷抗原包括成蟲蟲體粗提抗原、囊液抗原、原頭節 蟲體抗原及其分泌物抗原等許多種類。用于診斷的成蟲粗抗原雖然敏感性較高，但是特異 性很低。純化后的抗原雖然特異性較粗提抗原高，但是敏感性同時也降低了。有些抗原又 具有時限性，有些抗原處理與制備操作復雜。對于重組抗原，應用于診斷領域的主要為Ag5 和AgB，但其常與其他寄生蟲發生交叉反應。因此目前還有針對犬細粒棘球絳蟲診斷的金 標準抗原。糞抗原的檢測方法主要有檳榔堿導瀉法、ELISA方法、PCR方法等，但是檳榔堿 導瀉法的反應率具有一定的局限性；ELISA方法常出現敏感性低，并伴有一定的交叉反應； PCR方法常出現假陽性，并對儀器要求較高。至今也沒有檢測犬細粒棘球絳蟲的金標準方 法。因此，選擇高特異性的抗原，建立具有高敏感性、高特異性的犬細粒棘球絳蟲糞抗原的 診斷方法十分必要。
[0003]
【發明內容】
： 本發明公開了一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因，采用細粒棘球絳蟲兔高免血清對 本實驗室保存的細粒棘球絳蟲CDNA文庫進行相關抗原篩選，篩選出具有價值開放性閱讀 框的基因。
[0004] 本發明所述的一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因，如SEQ ID NO 1所示。
[0005] 該序列具有864bp的開放性閱讀框，編碼288個氨基酸，基因序列經NCBI BLAST 氨基酸同源性分析與多房棘球絳蟲診斷抗原gp50 (Echinococcus multilocularis diagnostic antigen gp50)的氨基酸序列（O3J06164. 1)有92%同源性，是一個未知的新基 因，命名為：EdiagA864。
[0006] 對本發明基因的編碼蛋白經Sopma在線分析預測二級結構，其a -螺旋占10. 07%， 延伸鏈占33. 33%，無規則卷曲占56. 60%。延伸鏈和無規則卷曲共占89. 93% ;CBS在線預測 TMHMM跨膜結構分析，該基因編碼蛋白為胞外蛋白；該蛋白具有含有B細胞表位的結構基 礎。經 CBS Prediction Servers Linear B-cell epitopes 預測分析及 DNAMAN 親水性及 疏水性分析，為構建有效的疫苗或診斷方法奠定基礎，也為制備單克隆抗體與多克隆抗體 提供高特異性的抗原，建立了快速、特異性的檢出犬細粒棘球絳蟲糞抗原的雙抗夾心ELISA 檢測方法，對犬細粒棘球絳蟲的防治提供新的依據或工具。
[0007] 本發明還提供了該基因蛋白的原核表達載體，其特征在于： 通過PCR方法擴增編號為EdiagA864的目的基因，其大小為864bp，回收該DNA后 連接PMD-18T克隆載體，載體構建完成后經雙酶切鑒定及測序比對后確定該基因的克隆 載體構建成功后，再將該基因與pET-32a載體連接，成功構建表達載體。表達載體轉入 Transetta(DE3)大腸桿菌感受態后，誘導其表達可得到51kDa左右的蛋白條帶，經Western Blot檢測分析其具有良好的反應原性，為研制犬細粒棘球絳蟲成蟲的診斷抗原或疫苗奠定 了基礎。
[0008] 本發明所述的一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因的制備方法，包括以下步驟： 首先采用SEREX技術對細粒棘球絳蟲cDNA文庫進行相關抗原篩選。對文庫A噬菌 體進行平板培養，去除交叉抗體反應后用IPTG誘導其表達，用兔抗細粒棘球絳蟲成蟲高免 血清、HRP標記的羊抗兔IgG對所表達的蛋白進行陽性篩選。對其篩選出的陽性噬菌斑進 行插入基因的克隆及分析，獲得基因并命名。然后對其進行開放性閱讀框PCR擴增，連接 PMD-18T構建克隆載體，經雙酶切鑒定及測序比對后確定該基因的克隆載體構建成功后，再 將該基因與pET-32a載體連接，成功構建表達載體。表達載體轉入Transetta(DE3)大腸桿 菌感受態后，誘導其表達。最后對表達蛋白進行SDS-PAGE電泳及Western Blot檢測分析 其反應原性。
[0009] 本發明進一步提供了基于該基因蛋白的犬細粒棘球絳蟲雙抗夾心ELISA檢測方 法，用于檢測犬科動物是否感染犬細粒棘球絳蟲，解決了檳榔堿導瀉法的反應局限性及危 險性，檢測血清特異性檢測循環抗原及抗體等方法的不足，快速、特異性地檢出犬細粒棘球 絳蟲的感染，適用于工業化生產。
[0010] 所用捕獲抗體為利用在大腸桿菌方.cWi (DE3)表達的EdiagA864蛋白作為抗原， 經免疫、細胞融合獲得了雜交瘤細胞株，經腹水收集純化而得的單克隆抗體；所用抗體稀釋 液為pH值7. 4的磷酸鹽緩沖液；包被液為pH值9. 6的碳酸鹽緩沖液；封閉液為5%的脫脂 奶粉PBST液；洗滌液為Tween-20含量為0? 5%的0? Olmol/L的pH值7. 4的PBST溶液；終 止液為2mol/L H2S04溶液；酶標抗體為以重組蛋白EdiagA864為抗原，辣根過氧化物酶標記 免疫后的兔多克隆抗體；底物溶液為pH值5. 0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液和H202配置的鄰苯 二胺（0PD);樣品稀釋液為Tween-20含量為0? 3%的0? Olmol/L的pH值7. 4的PBST溶液。
[0011] 本發明的積極效果在于：提供了一種細粒棘球絳蟲成蟲診斷蛋白基因的編碼蛋 白，經Sopma分析其二級結構，具有含有B細胞表位的結構基礎。經CBS在線預測TMHMM跨 膜結構分析，該基因編碼蛋白為胞外蛋白。大部分抗原決定簇都位于親水區。以在大腸桿菌 A cWi (DE3)表達的EdiagA864蛋白作為抗原，經免疫、細胞融合獲得了雜交瘤細胞株，經 腹水收集純化而得了單克隆抗體；以EdiagA864重組蛋白為抗原，經辣根過氧化物酶標記， 獲得了酶標兔抗EdiagA864多克隆抗體，建立了檢測犬細粒棘球絳蟲的雙抗體夾心ELISA 方法。
[0012] 本發明采用單克隆抗體與多克隆抗體，增加了雙單克隆抗體夾心ELISA的敏感 性，減少了雙多克隆抗體夾心ELISA反應的假陽性率。以該蛋白為基礎建立的犬細粒棘球 絳蟲檢測方法特異性高、敏感性強、重復性好。具有操作簡單、檢測快速，易于判斷等優點， 適合于臨床的快速診斷和牧區、村鎮等流行病學調查大規模應用。
[0013] 利用本發明的基因蛋白建立的雙抗夾心ELISA可用于制備試劑盒，且所有試劑均 為已配制好的工作液，可以直接操作無需處理，減少了操作步驟，可以快速，靈敏檢測待檢 樣品中的細粒棘球絳蟲抗原，避免了復雜的操作，對設備要求低，可以適應多種檢測環境； 且樣本用量小，采集方便，試劑保存時間長，對操作者無毒性，對環境無污染等；因此本發明 篩選出的基因蛋白與應用制備的單克隆抗體及多克隆抗體建立的雙抗夾心ELISA檢測方 法均具有重大的社會意義和廣闊的市場前景。且該犬細粒棘球絳蟲基因蛋白不僅可用于建 立診斷方法，還應用與疫苗等領域，具有很大應用前景。
[0014]
【附圖說明】： 圖1篩選結果； 圖2陽性噬菌斑的插入片段PCR擴增； 圖3為二級結構預測； 圖4為跨膜結構分析； 圖5為抗原決定簇預測分析； 圖6為疏水性分析； 圖7為親水性分析； 圖8為ORF EdiagA864基因PCR擴增； 圖9為EdiagA864-pMD-18T克隆載體雙酶切鑒定結果； 圖10為EdiagA864-pET-32a表達載體雙酶切鑒定結果； 圖11為EdiagA864-pET-32a重組蛋白SDS-PAGE電泳結果； 圖 12 為 EdiagA864-pET_32a 重組蛋白 Western blot 鑒定結果； 圖 13 為 EdiagA864 蛋白純化 SDS-PAGE 結果，l:Marker ;2-5 :1-4 號收集管； 圖14為SDS-PAGE驗證腹水抗體的純化效果； 圖15為多克隆抗體的純化，1-2 :純化后；M :Marker ;3 :未純化； 圖16為多克隆抗體Western blot鑒定結果，1-2:上樣量為10 yL;3-4:上樣量為 2 y L ;M :Marke〇
[0015]
【具體實施方式】： 下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解到，在 不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本發明的 待批權利要求范圍內。
[0016] 實施例1: 免疫相關抗原基因的篩選鑒定及原核表達 1. A噬菌體平板培養 取30 y L XLl-Blue菌種接于含四環素LB液體的試管中，37°C搖床過夜；取4mL菌液 5000g離心5min，棄上清，加入200 y L高壓滅菌的10mM硫酸鎂重懸細菌；加入重懸菌液 200 y L，1 X A Buffer 100 y L和細粒棘球絳蟲cDNA文庫100 y L混合均勻，于37°C水浴 20min ;加入48°C的LB/MgSOjM層瓊脂3mL，混勻倒入提前預熱的LB平板上并鋪平，凝固后 倒放于37°C培養箱，直至平板上長出針尖樣大小的噬菌斑。
[0017] 2 ?去除交叉抗體反應 將XLl-Blue接種于含四環素抗性的LB液體培養基里，放于37°C搖床培養過夜；離心 棄去上清后，用PBS重懸沉淀，超聲破碎；對XLl-Blue A cWi裂解液12000g離心10min ; 取lmL上清加入20 y L的兔高免血清于4°C過夜反應。
[0018] 3. B策菌斑的蛋白誘導表達 向90mm培養皿中加入19mL TNT溶液，加入lmL IPTG ;取硝酸纖維素膜（NC膜)浸泡入 培養皿lOmin ;濾紙吸取膜上面殘留的液體，平板倒放于37°C培養箱培養8h ;將取出的NC 膜放入含2mL滅菌胎牛血清的20mL TNT緩沖液中，振蕩片刻后，放入4°C冰箱中，過夜封閉。
[0019] 4.檢測噬菌斑中表達的融合蛋白 取出封閉后的NC膜，棄去封閉液后，TNT緩沖液洗滌3次/5min ;將NC膜放入含有 50 y L去處交叉抗體(兔高免血清終含量為1 y L)的20mL TNT緩沖液中，孵育5h ;TNT緩沖 液洗滌3次/5min ;將NC膜放入含有6 y L羊抗兔IgG的20mL TNT緩沖液中，孵育2h ;加入 各一滴DAB顯色液顯色，再用蒸餾水終止反應；將NC膜上的呈陽性的斑點與平板上的陽性 噬菌斑對應，吸取出噬菌體，加入200 y L含氯仿的SM緩沖液，放于4°C進行過夜反應(見圖 1)〇
[0020] 5?插入基因的克隆及分析 使用該噬菌體的插入片段擴增引物進行PCR，以含有噬菌體的SM