一種與草甘膦特異結合的核酸適配體及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與草甘膦特異結合的核酸適配體及應用，屬于生物醫學技術領 域。
【背景技術】
[0002] 草甘膦屬低毒除草劑，主要抑制植物體內的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而 抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化，使蛋白質合成受到干擾，導致植物死亡。 而在果蔬、轉基因大豆等制品中會有殘留的草甘膦，人誤食后15分鐘內便產生嘔吐及喉部 疼痛現象，接著還會產生腹痛及腹瀉癥狀，另外，草甘膦還與先天性心臟病以及其他先天畸 形有關。因此，如何快速、準確、靈敏地檢測出草甘膦防患于未然已成為亟待解決的問題。
[0003] 核酸適配體是通過SELEX技術，從特定的寡核苷酸庫中篩選得到的，能與靶分子 特異性、高親和力地結合的一類寡核苷酸分子（DNA或RNA)。由于其具有靶分子范圍廣、分 子質量小、免疫原性低、易于化學合成、改造和標記等優點，核酸適配體在臨床診斷鑒定和 疾病治療領域中顯示出了重要的應用價值。
[0004] 發明人將本發明的草甘膦特異性核酸適配體的核苷酸序列和基因數據庫進行了 比對搜索，未發現有任何相同序列信息。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種與草甘膦特異性結合的核酸適配體，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :1所示；該核酸適配體為單鏈DNA，由84個核苷酸組成，拓撲學結構為直鏈狀； 預測的二級結構具有突出的環和莖，存在G-四鏈體結構，吉布斯自由能DG=-16. 78。
[0006] 本發明另一目的是將與草甘膦特異性結合的核酸適配體應用在識別草甘膦或在 制備檢測草甘膦的試劑盒中。
[0007] 本發明的技術方案如下： 1、 草甘膦特異性核酸適配體(A08)的篩選、克隆、分離和測序 采用SELEX技術篩選出能夠與草甘膦特異性結合的核酸適配體群體，設計引物進 行PCR擴增、克隆、分離和測序。利用酶聯寡核苷酸吸附試驗（EL0NA)進行驗證，得到 適配體A08,它能夠高親和力高特異性的結合草甘膦。配體接頭引物序列為：Aptamer Fw: GACATAITCAGTCTGACAGC;反向互補序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATAITCGTCCATC，反向互補序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所獲陽性單克隆進行 核苷酸序列測定，測序結果表明與草甘膦特異性結合的核酸適配體（A08)由84個核苷酸組 成，其序列（5'端至3'端）為： tgctagacga tattcgtcca tccgagcccg tggcgggctt taggactctg cgggcttcgc ggcgctgtca gactgaatat gtca ； 2、 核酸適配體（A08)單鏈DNA二級結構表征 使用 MF0LD 軟件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA_Folding-Form)對與 草甘膦特異性結合的核酸適配體A08單鏈DNA分子進行二級結構預測，結果表明，其二級結 構具有突出的環和莖，存在G-四鏈體結構，吉布斯自由能DG=-16. 78,顯示該結構具有較高 的穩定性；其二級結構如下：
3、核酸適配體(A08)的特異性和對草甘膦的敏感性 根據核酸適配體A08的序列，用體外轉錄方法合成生物素標記的核酸適配體，建立了 一種新型的酶聯寡核苷酸檢測方法，通過此方法對A08的特異性和其對草甘膦的敏感性進 行檢測；結果顯示，A08具有很高的特異性，其能檢測到草甘膦的最低濃度為4 ng/ y L。
[0008] 本發明的意義在于： 利用SELEX技術篩選出的配體A08能夠高親和力高特異性的識別并結合草甘膦；核酸 適配體A08的鑒別對于食品中殘留的草甘膦的檢測，進而降低草甘膦對人體的侵害具有重 要意義。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發明中⑶圓二色譜法對K+濃度與核酸適配體A08的關系的分析； 圖2為本發明中EL0NA法對核酸適配體A08的特異性分析，圖中：空白對照1為草甘膦 +脫脂奶；空白對照2為草甘膦+不含配體的生物素；陰性對照1為蘇丹紅+標記有生物素 的配體A08 ;陰性對照2為三聚氰胺+標記有生物素的配體A08 ;陰性對照3為a -鵝膏毒 肽+標記有生物素的配體A08 ;陰性對照4為瘦肉精+標記有生物素的配體A08 ;陰性對照 5為乙型腦炎NS1蛋白+標記有生物素的配體A08 ;陰性對照6為乙型腦炎core蛋白+標 記有生物素的配體A08 ;草甘膦：草甘膦40 ng/iiL +標記有生物素的配體A08 ; 圖3為本發明中Dot Blot法對核酸適配體A08的特異性分析，圖中：1 :空白對照(草甘 膦+脫脂奶）；2 :空白對照(草甘膦+不含配體的生物素）;3 :陰性對照(蘇丹紅+標記有生 物素的配體A08) ;4 :陰性對照(三聚氰胺+標記有生物素的配體A08) ;5 :陰性對照（a -鵝 膏毒肽+標記有生物素的配體A08) ;6 :陰性對照（瘦肉精+標記有生物素的配體A08) ;7 : 陰性對照（乙型腦炎NS1蛋白+標記有生物素的配體A08) ;8 :陰性對照（乙型腦炎core蛋 白+標記有生物素的配體A08) ;9 :草甘膦40 ng/ y L +標記有生物素的配體A08 ; 圖4為本發明中EL0NA法對核酸適配體A08的最佳濃度的分析，圖中：空白對照1 :草 甘膦+脫脂奶；空白對照2 :草甘膦+不含配體的生物素；配體A08 :草甘膦+標記有生物素 的配體A08 ; 圖5為本發明中EL0NA法對草甘膦靈敏度的分析，圖中：空白對照：草甘膦+脫脂奶； 適配體A08 :草甘膦+標記有生物素的配體A08。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合附圖和實施例來進一步說明本發明的實質性內容，實施例僅為了更好理 解本發明但不局限與本發明范圍，實施例中方法如無特殊說明均為常規方法，使用的試劑 如無特殊說明均為常規市售試劑或按常規方法配制的試劑。
[0011] 實施例1:草甘膦核酸適配體(A08)的篩選 一、配基(草甘膦）與基質(瓊脂糖凝膠6B)的偶聯 1、在3 mL蒸餾水中懸浮1 g的凍干粉末瓊脂糖凝膠6B (1 g凍干的粉末能夠產生出 大約3. 0 mL的最終的基質體積）； 2、立即在燒結玻璃濾器中（多空度G3)用大約每克粉末200 mL的蒸餾水沖洗1小時； 3、 用6 mL的偶聯緩沖溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)溶解6 g的配基，使其最 終濃度為1 mg/mL，或者用脫鹽柱將溶解的配基轉移到偶聯緩沖溶液中，調整水相的pH值； 4、 將基質與上述步驟3中的濃度為1 mg/mL溶解好配基的緩沖溶液的比例調整為體積 比1:2,在25°C到40°C的水浴條件下，混合16 h，并且37°C搖床過夜； 5、 在40°C到50°C的條件下，用1M的氨基乙醇封閉過剩的基團，至少4 h或者過夜； 6、 用偶聯緩沖液洗過剩的配基，4000 rpm離心2 min，吸取上清；用超純水(每次7-8 mL)清洗3次；緊接著用0. 1 M NaHC03,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0. 1 M醋酸鹽，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用質量百分比濃度為20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，豎直放置。
[0012] 二、核酸適配體文庫（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA適配體文庫； 1、 94°(：預熱？0?儀； 2、 將 3 yL ssDNA、30.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP 混合物(各2. 5yM)、2yL正向擴增引物、2yL反向擴增引物以及0. 4 yL Taq酶離心管 進行反應。正向擴增引物序列為5 ' - GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '，反向擴增引物序列為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0013] 3、在PCR儀中按以下程序擴增 (1) 預變性 94 °C 5分鐘； (2) 40個循環 94 °C 45秒鐘 58 °C 45秒鐘 72 °C 30 秒鐘； (3) 后擴增 72 °C 7分鐘。
[0014] 三、配體庫的純化、上樣及洗脫 1、配體庫的純化 (1) 核酸適配體文庫PCR產物直接與膠回收試劑盒里的溶液按體積比1:1比例混合，進 行DNA片段回收； (2) DNA片段回收后，95°C水浴lOmin，冰浴lOmin ;經過此變性處理，使雙鏈DNA變成單 鏈 DNA。
[0015] 2、親和層析 (1) 用偶聯緩沖液洗脫偶聯過的基質：先吸取上層酒精，加偶聯緩沖液至6 mL，混勻， 離心，棄去上清液，此步驟重復3次； (2) 將上述第1步中的單鏈DNA加入到偶聯過的基質中，于37°C溫育并40 rpm輕柔轉 動2 h ; (3) 加入前述樣品到層析柱中，用2-3柱體積的超純水沖洗柱子； (4) 然后用3-4柱體積的洗脫緩沖液（0. 1 M NaCl，0. 1 M醋酸鹽，pH 4.0)進行線性梯 度洗脫，收集洗脫組分； (5) 洗脫組分與膠溶液等體積混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
[0016] 四、PCR優化和大量擴增核酸適配體 以上述selex溶液作為模板，按如下步驟操作： 1、 94°(：預熱？0?儀； 2、 將5 yL 模板、28.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP混 合物(各2.5uM)、2 yL正向擴增引物、2 yL反向擴增引物、0.4 yLTaq酶，于PCR離心 管中進行反應。正向擴增引物序列為5' -GACATATTCAGTCTGACAGC-3'，反向擴增引物序列 為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0017] 3、在PCR儀中按以下程序擴增： (1) 預變性 94 °C 5分鐘； (2) 37個循環： 94 °C 45秒鐘 58 °C 45秒鐘 72 °C 30 秒鐘； (3)后擴增 72 °C 7分鐘； 4、循環結束后，將PCR產物用TIANGEN公司的DNA產物純化試劑盒進行抽提回收，步 驟如下： (1) 將PCR產物與等體積的膜結合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉入離心純化柱，室 溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結合，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液； (2) 加入700 ML的漂洗液(含乙醇）于離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液； (3) 重復步驟（2); (4) 12000 rpm 離心 3 分鐘； (5) 將離心純化柱置于新的離心管中； (6) 加入30 ML超純水，在室溫下靜置5分鐘； (7) 12000 rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過的核酸適配體的PCR產物。
[0018] 實施例2: