Hla基因的組特異性擴增引物、測序分型方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學及免疫遺傳學，特別是涉及HLA基因的組特異性擴增引物、 測序分型方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人類白細胞抗原系統（HLA)是人基因組中多樣性最高、最重要的免疫遺傳系統， 它的多樣性決定了機體對感染性疾病、自身免疫性疾病、遺傳病及各種腫瘤的抵抗能力。在 臨床應用中，它的基因多態性在供受者之間的匹配程度高低直接決定了造血干細胞移植以 及器官移植病患的存活率。
[0003] 在HLA組織配型產業領域，目前國內外市場中的產品有三大短板問題：首先， 大部分產品都只針對HLA基因的部分外顯子進行分型，如只對HLA-I類基因（包括 HLA-A、-B、-C)的2、3、4三個外顯子進行分型檢測，而實際上HLA-I類全長基因總共含有 七個外顯子、七個內含子及兩端調控區，絕對高分結果命名數總共有8位，如A*02 :01 :01 : 01，而目前的國內外試劑只能判定出前4位結果，因此若HLA單核苷酸多態性位于試劑所 檢測外顯子以外的區域，便很容易產生模棱兩可無法判定的結果（Ambiguities)。目前的 HLA分型產品模棱兩可比例高達40 % -60 %。其次，目前市場上HLA的分型產品PCR擴增 引物設計的都是位點通用性的，即同一位點用同一對擴增引物去擴增所有人群的HLA基因 序列，由于HLA基因的等位基因數目繁多，截止到2015年1月，國際上統計的HLA-A、-B、-C 等位基因數目分別達2995、3760及2553個（代16&86 3.19.0，111^。：//\￥￥￥.613；[.&(3.111<:/1卩(1/ imgt/hla)，按血清學分類分別達28、60及10個，各血清學家系中包含的等位基因之間序列 差別較大，給位點通用擴增引物的設計帶來較大麻煩，即使勉強設計出來，也很容易產生部 分家系等位基因的漏檢（Allele dropout)，美國Atria公司也曾經通報過其HLA測序產品 存在這一現象。最后，傳統的HLA測序分型技術都是對父系母系雙倍體進行擴增，由于HLA 多樣性高，密度極高的雜合子峰增加了軟件開發和結果分析的難度和時間。
[0004] CN 101962676A公開了一種人類白細胞抗原HLA-A、B基因全長序列測定以及HLA 基因測序分型方法，HLA-A、-B基因全長序列測定方法包括：a、各由一對引物對HLA-A、B基 因約4kb全長序列進行PCR擴增；b、將擴增產物克隆至pGEM-Tea sy體中，分別通過正、 反雙向十條步移測序引物將全長序列測通，共獲得HLA-A 38種等位基因4. 3kb全長序列， HLA-B 30種等位基因3. 7kb全長序列。還是采用了位點通用性的引物，容易造成部分家系 等位基因的漏檢。
【發明內容】
[0005] 本發明致力于解決上述目前國內外HLA高分辨測序分型技術上的三大短板問題， 解決現有HLA測序分型廣品的缺陷，達到受檢標本的HLA絕對尚分，本發明提供一種HLA基 因的組特異性擴增引物、測序分型方法和試劑盒。
[0006] 為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：
[0007] 第一方面，本發明提供了HLA基因的組特異性擴增引物，所述PCR擴增引物序列選 自：SEQIDN0. 1-28所示的序列，SEQIDN0. 29-64所示的序列和SEQIDN0. 65-94所示的 序列。
[0008] 本發明根據HLA-A、-B、-C基因的組特異性分類，分別設計基因全長單倍型組特異 性擴增引物對HLA-A、-B、-C基因進行擴增；完成擴增后，為每個基因設計一套通用正反向 全長測序引物對HLA基因所有外顯子及內含子進行測序。
[0009] 優選地，所述SEQ ID N0. 1-28所示的序列是用于擴增HLA-A基因的引物序列。
[0010] 優選地，所述SEQ ID N0. 1-2所示的序列是用于擴增HLA-A*和A*36子系的所有 等位基因。
[0011] 優選地，所述SEQ ID N0. 3-4所示的序列是用于擴增見^4*02^*68)*69和六*80 子系的所有等位基因。
[0012] 優選地，所述SEQ ID N0. 5-6所示的序列是用于擴增HLA-A*02和A*69子系的所 有等位基因。
[0013] 優選地，所述SEQ ID N0. 7-8所示的序列是用于擴增HLA-A*01、A*36、A*68、A*69 和A*80子系的所有等位基因。
[0014] 優選地，所述SEQ ID N0. 9-10所示的序列是用于擴增HLA-A*23和A*24子系的所 有等位基因。
[0015] 優選地，所述SEQ ID N0. 11-12所示的序列是用于擴增HLA-A*31和A*33子系的 所有等位基因。
[0016] 優選地，所述SEQ ID N0. 13-14所示的序列是用于擴增HLA-A*29、A*32和A*74子 系的所有等位基因。
[0017] 優選地，所述SEQ ID N0. 15-16所示的序列是用于擴增HLA-A*03和A*30子系的 所有等位基因。
[0018] 優選地，所述SEQ ID N0. 17-18所示的序列是用于擴增HLA-A*01、A*02、A*03、 A*11、A*36、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因〇
[0019] 優選地，所述SEQ ID NO. 19-20所示的序列是用于擴增HLA-A*30子系的所有等位 基因。
[0020] 優選地，所述SEQ ID N0. 21-22所示的序列是用于擴增HLA-A*11子系的所有等位 基因。
[0021] 優選地，所述SEQ ID N0. 23-24所示的序列是用于擴增HLA-A*29和A*80子系的 所有等位基因。
[0022] 優選地，所述SEQ ID N0. 25-26所示的序列是用于擴增HLA-A*25、A*26、A*29、 A*31、A*32、A*33、A*34、A*66、A*74 和 A*43 子系的所有等位基因。
[0023] 優選地，所述SEQ ID NO. 27-28所示的序列是用于擴增HLA-A所有血清學家系的 等位基因，作為陽性對照。。
[0024] 本發明中，上述的HLA-A基因的組特異性PCR擴增引物序列，如表1所示。
[0025]表1
[0026]
[0027]
[0028] 注：引物名稱中的"F"和"R"分別表示引物的上游和下游。
[0029] 優選地，所述SEQ ID N0. 29-64所示的序列是用于擴增HLA-B基因的引物序列。
[0030] 優選地，所述SEQ ID N0. 29-30所示的序列是用于擴增HLA-B*07和B*48子系的 所有等位基因。
[0031] 優選地，所述SEQ ID N0. 31-32所示的序列是用于擴增HLA-B*08子系的所有等位 基因。
[0032] 優選地，所述SEQ ID N0. 33-34所示的序列是用于擴增HLA-B* 13子系的所有等位 基因。
[0033] 優選地，所述SEQ ID N0. 35-36所示的序列是用于擴增HLA-B*15和B*46子系的 所有等位基因。
[0034] 優選地，所述SEQ ID N0. 37-38所示的序列是用于擴增HLA-B*14、B*38、B*39和 B*67子系的所有等位基因。
[0035] 優選地，所述SEQ ID N0. 39-40所示的序列是用于擴增HLA-B*15、B*51和B*52子 系的所有等位基因。
[0036] 優選地，所述SEQ ID NO. 41-42所示的序列是用于擴增HLA-B*35和B*73子系的 所有等位基因。
[0037] 優選地，所述SEQ ID N0. 43-44所示的序列是用于擴增HLA-B*18、B*44、B*73和 B*82子系的所有等位基因。
[0038] 優選地，所述SEQ ID N0. 45-46所示的序列是用于擴增HLA-B*07、B*40 :01和B*81 子系的所有等位基因。
[0039] 優選地，所述SEQ ID N0. 47-48所示的序列是用于擴增HLA-B*18、B*27、B*37和 B*40 :02/06子系的所有等位基因。
[0040] 優選地，所述SEQ ID N0. 49-50所示的序列是用于擴增HLA-B*41、B*45、B*49和 B*50子系的所有等位基因。
[0041] 優選地，所述SEQ ID N0. 51-52所示的序列是用于擴增HLA-B*42子系的所有等位 基因。
[0042] 優選地，所述SEQ ID N0. 53-54所示的序列是用于擴增HLA-B*54、B*55、B*56和 B*59子系的所有等位基因。
[0043] 優選地，所述SEQ ID N0. 55-56所示的序列是用于擴增HLA-B*57子系的所有等位 基因。
[0044] 優選地，所述SEQ ID N0. 57-58所示的序列是用于擴增HLA-B*18、B*27、B*35、 B*37、B*40、B*41、B*45、B*49、B*50、B*51、B*52、B*53、B*58 和 B*78 子系的所有等位基因。
[0045] 優選地，所述SEQ ID NO. 59-60所示的序列是用于擴增HLA-B*07、B*08、B*15、 B*42、B*44和B*47子系的所有等位基因。
[0046] 優選地，所述SEQ ID NO. 61-62所示的序列是用于擴增HLA-B*41、B*45、B*49、 B*50、B*51、B*52、B*53、B*58和B*78子系的所有等位基因。
[0047] 優選地，所述SEQ ID NO. 63-64所示的序列是用于擴增HLA-B*所有血清學家系的 等位基