一種荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農作物病害防治及植物檢疫領域，特別涉及一種荔枝霜疫霉菌LAMP 引物及其快速檢測方法和在荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的監測和鑒定中的應用。
【背景技術】
[0002] 蒸枝（Litchii chinensis Sonn.)是原產于我國南部和越南北部著名的熱帶亞 熱帶特產水果，在我國主要分布于廣東、廣西、福建、海南、臺灣、四川、云南、貴州、浙江等省 區。我國荔枝的種植面積和產量為世界之首，且大量出口。荔枝因其經濟價值高，是我國在 國際市場上最有競爭力的果品之一。隨著荔枝連作和種植面積的擴大，荔枝產業的發展主 要由真菌病害的發生和危害所影響，尤其是蒸枝霜疫霉病（Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)，是荔枝上最常見的主要真菌性病害，已成為影響荔枝生產的限制因子之一。 病菌主要危害近成熟的果實，也危害幼果、果柄、花穗和葉片，常造成大量爛果、落果和貯運 期間果品損失，嚴重時爛果率達到30~80%，嚴重威脅了荔枝的產量與品質，并常與其他 荔枝病害混合發生，給病害的診斷造成困難，而生產上則常因不明發病原因，難以有針對性 的防治措施，故造成更為嚴重的危害。因此建立荔枝霜疫霉菌快速檢測體系，早期對發病植 株進行荔枝霜疫霉菌的快速準確檢測，對預測病害發生情況、及時采取有效的防治措施控 制病原菌的傳播和流行、減少經濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]目前對荔枝霜疫霉菌的檢測大多仍沿用傳統的組織分離培養及形態學鑒定方法， 但是，這種鑒定方法耗時長，并且分離成功率不高。若是多種病原菌復合侵染，所分離的病 害樣本不新鮮，則更難確診病原菌，難以滿足對荔枝霜疫霉病診斷的實際需要，這對病原菌 的檢測和防控十分不利。
[0004]環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱 LAMP) 是2000年由日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。LAMP 反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物，利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶（Bst DNApolymerase)，在恒溫條件下（60~65°C )保溫30~90分鐘，即可完成擴增反應。由于 LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在短短的30~90分鐘內就能實現10 9~10 w 倍產物的擴增。LAMP擴增產物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度 觀察等方法。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。 目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中 報道極少，荔枝霜疫霉的檢測國內外均未見報道。
【發明內容】
[0005]為了克服上述現有技術中荔枝霜疫霉菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測 方法特異性差，靈敏度低的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種荔枝霜疫霉菌 (Peronophythora litchii)LAMP 引物。
[0006] 本發明另一目的在于提供一種基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速檢測方 法。該檢測方法結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高。
[0007] 本發明再一目的在于提供上述快速檢測方法在荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的 監測和鑒定中的應用。
[0008] 本發明的目的通過下述方案實現：
[0009] 一種蒸枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii)LAMP引物，包括內引物對F3和B3， 以及外引物對FIP和BIP，序列如下所示：
[0010] F3 :5, -TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3,；
[0011] B3 :5，-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3，；
[0012] FIP ：
[0013] 5' -AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3' ；
[0014] BIP ：
[0015] 5 ' -GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3 '。
[0016] 本發明還提供了一種基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速檢測方法，包括以 下步驟：
[0017] 以待檢測樣本的DNA為模板，利用上述引物進行LAMP反應擴增，再通過熒光染料 目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。
[0018] 所述LAMP反應體系優選為：25yL，其中F3與B3濃度分別為0.2yM，FIP與 BIP 濃度分別為 1.6yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KC1，2 ~4mM MgS04,0.1% Tween-20,0 ~1. 2M Betaine，ImM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，10 ~50ng DNA 模 板，不足部分用無菌雙蒸水補足；反應條件為在60~65°C溫育30~90min，80°C保溫5~ 10min〇
[0019] 所述LAMP反應體系更優選為：25 y L，其中F3與B3濃度分別為0. 2 y M，FIP與 BIP 濃度分別為 1.6yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KC1，2 ~4mM MgS04,0.1% Tween-20,0 ~1.2M Betaine，lmM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA 模板，不足 部分用無菌雙蒸水補足；反應條件為在65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。
[0020] 所述LAMP反應體系更優選為：25yL，其中F3與B3濃度分別為0. 2yM，FIP與BIP 濃度分別為 1.6 yM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04，10mM KCl，2mM MgS04,0. 1% Tween-20， 0.2M Betaine，lmM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸 水補足；反應條件為在65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。
[0021] 所述熒光染料目測觀察法：在LAMP反應的最終擴增產物中加入1 yL顯色劑，所述 顯色劑為SYBR Green I，觀察顯示結果。顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷 為陰性。
[0022] 所述的瓊脂糖凝膠電泳法：取6 y L LAMP反應的最終擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，觀察結果。如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷 為陰性。
[0023] 所述待檢測樣本的DNA優選通過DNA抽提試劑盒法提取。
[0024] 當所述的待檢測樣本為菌體時，優選使用真菌DNA抽提試劑盒法提取。
[0025] 當所述的待檢測樣本為植物組織時，優選使用植物組織DNA抽提試劑盒法提取。
[0026] 本發明檢測方法結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，適用于發病組織中荔 枝霜疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，可直接用于帶菌的植株高靈敏度快速檢測，可用于 荔枝霜疫霉菌的早期診斷、病菌的監測和鑒定中。本發明建立了荔枝霜疫霉菌快速、簡便、 特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于農業生產中荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的 早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0027] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及有益效果：
[0028] 1、結果可靠：本發明的LAMP引物及LAMP反應體系，已經對荔枝霜疫霉菌和帶荔枝 霜疫霉的植物組織進行了多次重復驗證，結果可靠。
[0029] 2、特異性強：本發明的LAMP引物是針對荔枝霜疫霉M90基因序列中6個不同區域 設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性 尚。
[0030] 3、靈敏度高：本發明的LAMP檢測方法對荔枝霜疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上 可達到lpg，比常規PCR檢測高1000倍。
[0031] 4、操作簡便快速：應用本發明方法，對帶荔枝霜疫霉菌的組織進行檢測可在1小 時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀 器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
【附圖說明】
[0032]圖1為荔枝霜疫霉菌的特異LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖。其中：泳道M為 DL 2000DNAmarker，泳道1為荔枝霜疫霉，泳道2為荔枝炭疽菌，泳道3為黃瓜疫霉菌，泳道 4為黃瓜腐霉菌，泳道5為陰性對照，泳道6為空白對照。