用于中國西門塔爾牛親子關系鑒定的微衛星標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子遺傳學領域，具體地說，涉及用于中國西門塔爾牛親子關系鑒定 的微衛星標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 系譜信息在牛育種中起著重要的作用。錯誤的系譜會大大降低遺傳評定準確性， 影響選種選配的效果，降低群體的遺傳進展，給養牛業帶來巨大經濟影響。然而，在實際養 殖生產中，系譜記錄錯誤是難免的，它受多種因素影響，如配種記錄、產犢記錄、系譜錄入及 整理中的人為錯誤等，尤其在飼養粗放的散養式牧場，犢牛出生后很難確定父親甚至雙親， 往往會造成系譜錯誤。
[0003] 目前，在我國牛親緣關系鑒定研究和應用最多的是微衛星標記法。田菲（2006 年）從30個微衛星標記中選擇9個標記和3個候選標記作為中國荷斯坦牛親子鑒定的 微衛星標記組合。賀建寧、宋玲（2010年）利用12個微衛星標記對西門塔爾牛親子鑒定 進行初步探討。周磊（2011年）對利用微衛星和SNP標記信息進行奶牛親子鑒定的模擬 進行了研究。郭立平（2013年）利用微衛星和SNP標記對西門塔爾牛進行親子推斷的研 究。另外，CN101024857A公開了中國荷斯坦奶牛的親子鑒定方法及其專用引物與試劑盒； CN101705299A公開了牛微衛星標記組合及其應用。由于不同物種微衛星標記的分布比例存 在差異；且高度近親的不同品種間，微衛星標記也存在一定保守性和差異性，同時微衛星標 記具有高度的個體特異性，兩個無關個體具有相同微衛星的概率低于10 4。
【發明內容】
[0004] 本發明針對中國西門塔爾牛牛群特點，旨在提供用于中國西門塔爾牛親子關系鑒 定的微衛星標記組合。另外，針對已有基因分型技術上存在著操作復雜、耗時、重復性低等 缺點，以及現有商業化試劑盒價格昂貴，檢測成本高等不足之處，通過檢測技術的改進，實 現在篩選基因型的同時達到檢測的目的。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明提供用于中國西門塔爾牛親子關系鑒定的微衛星標 記，由下述 10 個標記組成：TGLA53、BM2113、INRA023、TGLA122、CSSM66、ETH225、SPS115、 HAUT27、INRA037 和 ETH10。
[0006] 上述10個標記位于染色體的位置、引物等基本特征如下：
[0007]
[0008] 本發明還提供用于中國西門塔爾牛親子關系鑒定的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒 含有用于擴增所述微衛星標記的PCR引物。
[0009] 本發明還提供所述微衛星標記在中國西門塔爾牛親子關系鑒定中的應用。
[0010] 前述的應用是以待測牛的基因組DNA為模板，利用多重熒光PCR和毛細管電泳技 術結合進行基因型檢測。
[0011] 具體步驟包括：（1) DNA提取：牛血液或精液DNA提取；（2)熒光標記PCR擴增：擴 增所述10個微衛星標記特異性目的片段；（3)基因分型：熒光標記毛細管電泳技術分析所 述標記的基因型。
[0012] 具體操作過程如下：
[0013] 1、按照常規方法進行牛血液DNA提取或公牛凍精DNA的提取。
[0014] 2、根據擴增產物大小選擇引物所標記的熒光素，特別對于片段長度有重疊的標 記，用不同的熒光染料修飾，這樣可使不同顏色的微衛星標記同時檢測，提高檢測效率。（表 1)
[0015] 表1根據擴增產物大小選擇不同熒光素標記
[0016]
[0017] 通過優化擴增條件和調整引物濃度，篩選最佳PCR體系組成、擴增條件，建立了 10 個標記的最優擴增體系。
[0018] 以20 y L總體積為例，PCR擴增的反應體系見表2。
[0019] 表2PCR反應體系
[0020]
[0021] PCR反應條件見表3。
[0022] 表3 PCR反應條件
[0023]
[0024] 3、基因分型
[0025] 由于步驟2中PCR產物根據片段長度和不同熒光顏色進行了標記，因而通過3次 毛細管電泳即可獲得不同微衛星標記座位的基因型。
[0026] 將步驟2中每組PCR產物樣品板裝入ABI PRISM3730XL遺傳分析儀進行電泳。利 用GeneMaPPerTM4. 0軟件，設定分子量標準條帶后，根據遺傳分析儀所收集電泳熒光信號 的顏色和位置，自動計算各標記座位的基因型。
[0027] 進一步地，本發明是根據待測牛個體的基因型以及累積排除概率（Combined exclusion probabilities)確定待測中國西門塔爾牛親子關系，即根據待測牛個體和候選 親本的基因型是否一致以及計算待測個體與候選親本的累積排除概率來確定待測個體和 候選親本是否有親緣關系。其原理及計算過程如下：
[0028] 親子鑒定是基于孟德爾遺傳的兩個基本定律：分離和自由組合規律。子代的兩個 同對等位基因一個來自父親，一個來自母親。通過結果分析，如果符合孟德爾遺傳定律，則 不能排除具有親子關系，否則可排除其親子關系。根據孟德爾遺傳定律，后代染色體上的全 部基因，一半遺傳于其親生父親，一半遺傳于其親生母親。因此在應用微衛星基因座進行親 子鑒定時，（i)肯定子代的某個標記基因型來自親生父親，而候選父親并不攜帶此標記基因 型，這就違背了孟德爾遺傳定律，可以排除子代與候選父親之間的親緣關系；（ii)肯定子 代的某個標記基因型來自親生父親，而候選父親也攜帶此標記基因型，其符合孟德爾遺傳 定律，據此不能排除子代與候選父親之間的親緣關系，但是可以利用似然函數計算它們之 間親緣關系的相似程度。
[0029] 根據孟德爾遺傳定律，（1)如果累積排除概率> 0. 99,子代所檢測的標記基因型 與候選父親完全一致，可確定其為子代的生物學父親；（2)如果累積排除概率> 0. 99,子代 所檢測的標記基因型與候選父親存在2個或以上基因型不遵循遺傳規律，可排除其為子代 的生物學父親。
[0030] 首先，計算所檢測標記的非父排除概率及累積排除概率。非父排除概率 (probability of paternity exclusion，PE)是評價遺傳標記在親子鑒定中實用價值大小 的一個重要指標；是利用各位點的等位基因頻率來計算候選父親某標記的等位基因不是來 自親生父親的排除概率。非父排除概率的計算一般分以下三種情況計算：
[0031] (1)當另一親本信息未知時，排除子代與假設親本是親子關系的排除概率為：
[0032]
[0033] (2)當另一親本信息已知時，排除子代與假設親本是親子關系的排除概率為：
[0034]
[0035] (3)排除子代與無關的假設父母對是親子關系的排除概率為：
[0036]
[0037] 其中，n代表每個標記的等位基因數，Pl代表第i個等位基因的頻率。
[0038] k個標記的累積排除概率計算公式為：
[0039] CPE = l-d-PD (1_P2) (1_P3)…（l_Pk)
[0040] 在上述三種不同情況下，根據以上計算公式分別得出CPE(l)、CPE(2)、CPE(3)。 CPE(l)為第一種情況下的累積排除概率，即（1)當另一親本信息未知時，排除子代與假設 親本是親子關系的排除概率：CPE(2)為第二種情況下的累積排除概率，即當另一親本信息 已知時，排除子代與假設親本是親子關系的排除概率；CPE(3)為第三種情況下的累積排除 概率，即排除子代與無關的假設父母對是親子關系的排除概率，通過計算每個候選親本在 所有檢測位點排除概率，即可知道候選親本為子代真實親本的可能性大小，從而可對親子 對之間的親緣關系做出判斷。
[0041] 本發明進一步提供所述微衛星標記在中國西門塔爾牛遺傳改良育種中的應用。
[0042] 本發明針對中國西門塔爾牛牛群的特點，篩選出一組適用于檢測西門塔爾牛親子 關系的微衛星標記，共包括10個微衛星標記，這些標記多態性高、標記間不連鎖且片段大 小間隔適當，易于同時檢測。在三種不同情況下，利用此標記組合鑒定西門塔爾牛親子關 系，累積排除概率 CPE(l)、CPE(2)、CPE(3)分別達 0. 9960969、0. 999854、0. 9999997,檢測效 率極高。本發明利用多重熒光PCR和毛細管電泳技術，通過優化實驗體系，建立了基于上述 10個微衛星標記準確高效的基因分型方法。本發明的微衛星標記組合可用于中國西門塔爾 牛完整、準確的系譜鑒定，可提高中國西門塔爾牛育種準確性，加快其育種進程，具有良好 的應用前景和經濟效益。
【附圖說明】
[0043] 圖1為本發明實施例1中以標記ETH225和CSSM66為例的微衛星基因型分型結果。
【具體實施方式】
[0044] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實 施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0045] 以下實施例中述及的實驗牛群中國西門塔爾牛來自內蒙古烏拉蓋地區445頭中 國西門塔爾牛。
[0046] 實施例1中國西門塔爾牛親子關系鑒定微衛星標記的篩選與確定
[0047] 1、微衛星標記位點的選擇與分組
[0048] 根據文獻研究相關報道，選擇牛的14條不同染色體、多態信息含量較高的14個微 衛星基因座。選擇的原則是：具有豐富的等位基因、高度多態性，位于不同染色體上，彼此之 間沒有連鎖關系，重復性好，無"啞等位基因（Null Allele)"等。詳細信息見表4。
[0049] 表4 14個微衛星基因座基本信息
[0050]
[0052] 為降低微衛星基因分型的檢測成本，根據微衛星標記的片段長度和所攜帶的熒光 基團將PCR產物混合分組。為避免同一組中出現非特異性條帶干擾，每組中熒光顏色不同、 每個熒