一種中性纖維素酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于功能基因改造技術領域，具體涉及一種中性纖維素酶突變體及其應 用。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶，是一種復合酶，是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，習慣上將纖維素 酶分成三類：內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纖維素酶是在工業中應用最 廣泛的酶之一，一般應用于紡織工業、去污劑工業、紙漿和造紙工業、飼料和食品工業（包 括烘焙），以及用于木質纖維素材料水解，用于例如生物乙醇生產等。
[0003] 纖維素酶可以按照其一級序列分類成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成 員的三維結構分析的支持（Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。例如，糖 基水解酶家族5、7、12和45含有內切葡聚糖酶。大多數紡織用酸性纖維素酶屬于家族5,而 大多數紡織用中性纖維素酶為家族12或45。
[0004] 中性纖維素酶可廣泛應用在紡織領域，特別在棉織物整理上，經過纖維素酶整理 后，織物表面的絨毛被除去，處理后織物更光潔，顏色更鮮艷，棉織物的手感和外觀獲得很 大的改善。用于牛仔水洗整理，可解決傳統石洗的斷砂磨損和酸洗時的日久發黃等許多問 題，水洗的牛仔花點大小均勾，藍白對比鮮明，質地柔軟、舒適、美觀大方。
[0005] 但目前市售的中性纖維素酶種類較少，且普遍存在催化效率不高、產品儲存期較 短、酶活損失快等缺點，因此現在急需開發一款穩定性高，單位蛋白催化效率高且對織物強 力損失小的中性纖維素酶，以滿足工業生產的需求。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種中性纖維素酶突變體，其熱穩定性得到顯著提高，且在 紡織除毛和水洗的應用中具有更顯著的效果，可廣泛應用于紡織工業領域。
[0007] 本發明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQIDN0 :1的纖維 素酶第23位氨基酸由Pro變為Ser，第38位氨基酸由Leu變為lie，第213-284位氨基酸 序列替換成里氏木霉（Trichoderma reesei)來源的纖維素酶的第447-514位氨基酸序列。
[0008] 上述里氏木霉（Trichoderma reesei)來源的纖維素酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
[0009] 上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :5,其一種編碼基因的核酸序列 為 SEQ ID N0 :6。
[0010] 本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :6的纖維素酶突變體基因的 重組質粒。
[0011] 本發明還涉及一種工程菌株，其攜帶有上述重組質粒。
[0012] 所述工程菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0013] 本發明還涉及上述纖維素酶突變體在紡織領域中的應用。
[0014] 本發明所述纖維素酶突變體最適作用溫度為60°C，最適作用pH為6. 5,且在pH 6. 0-7. 0范圍內均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶的最適作用pH為5. 5,在 pH 5. 0-6.5范圍內維持80%以上的酶活。與野生型比較，本發明提供的纖維素酶突變體的 pH適用范圍更加偏向于中性條件，具有更大的應用空間。此外，纖維素酶突變體的耐熱性和 穩定性得到顯著提高，在42°C條件下存放35天后，仍能保持90%以上的殘留活性，而野生 型纖維素酶酶活僅殘留不足60%。
[0015] 本發明提供的纖維素酶突變體可廣泛應用于紡織加工領域，在pH 4. 0-8. 5范圍 內應用，效果良好；除毛干凈，對織物強力損失小；牛仔水洗，起花小，花點較小，批差穩定； 且相同蛋白含量的纖維素酶突變體的應用效果顯著優于野生型，能大大節約生產成本，提 高經濟效益。
【附圖說明】
[0016] 圖1為纖維素酶突變體與野生型相對酶活-pH曲線圖；
[0017] 圖2為纖維素酶突變體與野生型殘留酶活-時間曲線圖。
【具體實施方式】
[0018] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任 何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0019] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0020] 實施例1 :纖維素酶突變體的獲得
[0021] 為了提高野生型纖維素酶NCE4(氨基酸序列為SEQ IDN0:1，其編碼核苷酸序列為 SEQ IDN0:2)對溫度的耐受性和穩定性，申請人對該酶的氨基酸位點進行了大量的點突變 篩選，并對該酶原有的CBD結合域序列進行了大量替換篩選。在篩選過程中，申請人發現： 有些突變對纖維素酶的耐熱性沒有影響，而有些突變甚至會導致其耐熱性更差了，還有些 突變雖然能顯著提高纖維素酶的耐熱性，但酶活水平很低，不適用于工業生產。最終，申請 人篩選到一種既能使纖維素酶耐熱性和熱穩定性顯著提高、又不影響其酶活水平的突變位 點和CBD結合域序列的組合：野生型纖維素酶NCE4的第23位氨基酸由Pro變為Ser，第38 位氨基酸由Leu變為lie，第213-284位氨基酸序列替換為里氏木霉（Trichoderma reesei) 來源的纖維素酶的第447-514位氨基酸序列。
[0022] 所述里氏木霉（Trichoderma reesei)來源的纖維素酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
[0023]申請人將包含上述突變位點的纖維素酶突變體命名為NCE4-D，其氨基酸序列為 SEQ IDN0:5,編碼核苷酸序列為SEQ IDN0:6。
[0024] 申請人依照里氏木霉的密碼偏愛性對纖維素酶突變體的基因進行優化合成，并且 在合成序列5'和3'兩端分別加上Kpnl和Xbal兩個酶切位點。上述基因合成工作由上海 生工生物工程股份有限公司完成。
[0025] 同時，采用同樣的方法合成得到野生型纖維素酶NCE4的基因片段SEQ ID NO: 2。
[0026] 實施例2纖維素酶突變體的表達
[0027] 2. 1表達載體的構建
[0028] 將合成后的纖維素酶突變體基因序列和pTG載體分別用限制性內切酶Kpnl和 Xbal (Fermentas)進行酶切，使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用T4DNA連接酶 (Fermentas)將上述兩個酶切產物連接并轉化大腸桿菌Trans5 a (Transgen)，用氨節青霉 素進行選擇，并對克隆進行測序（Invitrogen)。測序正確后，即得到含有纖維素酶突變體基 因的重組載體PTG-NCE4-D。
[0029] 采用上述同樣方法構建得到含有野生型纖維素酶NCE4基因的重組載體 PTG-NCE4。
[0030] 2. 2重組菌株的構建及篩選
[0031] (1)原生質體制備
[0032] 接種里氏木霉（Trichoderma reesei) SCHD4菌絲于PDA平板上，30°C培養6天； 待其產孢豐富后，切取約lcmXlcm的菌落置于含120mL YEG+U(0. 5%酵母粉、1%葡萄糖、 0. 1%尿苷）的液體培養基中，30°C，220rpm振蕩培養14~16h ;
[0033] 多層紗布過濾收集菌絲，并用無菌水清洗一次；將菌絲體置于含有20mL10mg/mL 裂解酶液（SigmaL1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用1-2h;用顯微鏡觀察檢測原生質體 轉化進展；
[0034] 將預冷的20mL 1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，輕輕搖勾，用無菌Miracloth濾布過濾收集濾液，3000rpm，4°C離心10min ;棄上 清，加入預冷的5mL 1. 2M山梨醇溶液懸浮菌體，3000rpm，4°C離心10min ;棄上清，加入適量 預冷的1. 2M山梨醇懸浮分裝（200 y L/管，原生質體濃度為10s個/mL)。
[0035] (2) PEG介導的原生質體轉化與菌株驗證
[0036] 以下操作均在冰上進行，將10 y g重組質粒加入到200 y L上述原生質體溶液中， 接著加入50 y L25% PEG輕輕混勻，溫和混勻后在冰上放置20min，然后加入lmL25% PEG， 輕輕混勻，室溫靜置5min，然后加入2mL25 % PEG溶液和4mLl. 2M山梨醇溶液，溫和混勻 各管，把混合物輕輕加到50mL左右且熔化后冷卻至45-55°C的轉化上層培養基中（0. 1% MgS04,1 % KH2P04,0? 6 % (NH4) 2S04,1 % 葡萄糖，18. 3 % 山梨醇，0? 35 % 瓊脂糖，0? 1 %微量元 素（微量元素：在 250mL dlH20 中加入 lg FeS04.7H20,8. 8g ZnS04.71120,0. 4g CuS04.5H20， 0? 15g MnS04 ? 4H20,0. lg Na2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6Mo70 24 ? 4H20,0. 2mL 濃 HC1，完全 溶解后用dlH20定容至1L))，輕輕混勻后倒入轉化下層培養基平板（2%葡萄糖，0.5% (順4) 2504，1.5%腿風0.06%]\%504,0 . 06%〇&(：12，1.5%瓊脂，0.1%微量元素），30。(：培 養5~7d至轉化子長出。
[0037] 挑取轉化子至下層培養基平板，30°C培養2d;取適量菌絲體置于2mL離心管中，加 入 100mg無菌石英砂和 400 yL抽提緩沖液（100mM Tris-HCl, 100mM EDTA，250mM NaCl, 1% SDS);用珠打儀劇烈振蕩2min ;65°C水浴20min后，加入200 y L 10M NH4AC，冰浴lOmin ; 13000rpm離心10min ;取上清，加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ;13000rpm離心 10min，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加水