突變型Taq DNA聚合酶及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種突變型TaqDNA聚合酶及其制備方法 和應用。
【背景技術】
[0002] TaqDNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，由水生棲熱菌中分離得到的。1969年在 美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離得到一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus)YT_l， 它能生長在70°C~75°C極富含礦物質的環境中。1976年，A.Chien從水生棲熱菌中分離 純化得到了耐熱的TaqDNA聚合酶。1983年karyMullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR)， 1988年RandalIK.Saiki等也從水生棲熱菌中分離純化得到TaqDNA聚合酶并將它應用于 PCR技術，實現了PCR過程自動連續循環。現有的研究表明，TaqDNA聚合酶屬于DNA聚合 酶I家族，酶基因全長2496個堿基，編碼832個氨基酸，分子量為94kD。TaqDNA聚合酶在 70°C~75°C時具有最高的生物學活性，在92. 5°C酶活性可持續130min，95°C持續40min， 97. 5°C持續5min~6min可保持約50%的酶活性。
[0003] 在PCR反應中使用TaqDNA聚合酶，由于TaqDNA聚合酶在高溫下能保持一定的 活性，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷，大大降低了成本。然而，隨著PCR技 術的日益推廣和應用，研究人員對TaqDNA聚合酶性能要求不斷提高。野生型TaqDNA聚 合酶結構上的缺陷，使其在許多應用領域受到限制。現有的TaqDNA聚合酶活性低、耐受性 低，不能滿足工業生產及科研應用的需求。
【發明內容】
[0004] 基于此，有必要提供一種酶活性高、耐受性高的突變型TaqDNA聚合酶，以及其制 備方法和應用。
[0005] 一種突變型TaqDNA聚合酶，包括：
[0006](a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0007] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0008] (c)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0009] 一種突變型TaqDNA聚合酶，包括：
[0010] (a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0011] (b)、與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽； 或
[0012] (c)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。
[0013] -種突變型TaqDNA聚合酶的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 步驟一、提供用于表達突變型TaqDNA聚合酶的基因表達序列，所述突變型Taq DNA聚合酶包括：（a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)、與SEQIDNo. 2 所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或（c)、由SEQIDNo.2所示的 氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽；
[0015] 步驟二、將所述基因表達序列連接到基因表達載體中；
[0016] 步驟三、將所述基因表達載體轉化到宿主細胞中，得到重組細胞；
[0017] 步驟四、對所述重組細胞進行誘導表達，收集菌體；
[0018] 步驟五、將所述菌體裂解，收集裂解粗產物；以及
[0019] 步驟六、利用Ni-親和柱純化所述裂解粗產物，得到所述突變型TaqDNA聚合酶。
[0020] 在一個實施例中，所述基因表達序列包括：
[0021] (a)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
[0022] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或
[0023] (c)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，其中一個或多個堿基被缺失、替代或增加得 到的核苷酸序列。
[0024] 在一個實施例中，所述基因表達載體為pET_28a。
[0025] 在一個實施例中，所述宿主細胞為原核細胞。
[0026] 在一個實施例中，所述原核細胞為BL21。
[0027] -種酶制劑，包括權利要求上述的突變型TaqDNA聚合酶。
[0028] 在一個實施例中，所述酶制劑還包括用于提高酶活性的金屬陽離子。
[0029] 上述的突變型TaqDNA聚合酶在制備PCR反應試劑領域中的應用。
[0030] 這種突變型TaqDNA聚合酶，將野生型TaqDNA聚合酶的第605位由亮氨酸突變 為精氨酸，第617位由精氨酸突變為苯丙氨酸，第667位由苯丙氨酸突變為亮氨酸，并將T3 DNA聚合酶的TBD區即262~337位氨基酸替代TaqDNA聚合酶拇指區的480~485位氨 基酸。上述定點突變使得突變型TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明顯的提高。這種突 變型TaqDNA聚合酶，由于具有較高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接擴增PCR 反應體系中。
【附圖說明】
[0031] 圖1為一實施方式的突變型TaqDNA聚合酶制備方法的流程圖；
[0032] 圖2a為實施例3中野生型TaqDNA聚合酶與本發明制得的突變型TaqDNA聚合 酶的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0033] 圖2b為實施例3中本發明制得的突變型TaqDNA聚合酶原酶液稀釋20倍的樣品 與原酶液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0034] 圖3a為突變型TaqDNA聚合酶的活性檢測結果；
[0035] 圖3b為野生型TaqDNA聚合酶的活性檢測結果；
[0036] 圖4a為熒光定量PCR檢測fermentas的TaqDNA聚合酶對核酸提取后的HBV靈 敏度模板檢出率結果；
[0037] 圖4b為熒光定量PCR檢測突變型TaqDNA聚合酶對免核酸提取后的HBV靈敏度 模板檢出率結果；
[0038] 圖4c為熒光定量PCR檢測野生型TaqDNA聚合酶對免核酸提取后的HBV靈敏度 模板檢出率結果。
【具體實施方式】
[0039] 下面主要結合附圖及具體實施例對突變型TaqDNA聚合酶及其制備方法和應用做 進一步的解釋說明。
[0040] 由于野生型TaqDNA聚合酶結構上的缺陷，使得其熱穩定性和特異性較差，活性和 耐受性較低，在許多應用領域受到限制。
[0041] 因此，本發明提供一種突變型TaqDNA聚合酶，通過對野生型TaqDNA聚合酶定點 突變，使得突變型TaqDNA聚合酶具有良好的熱穩定性和特異性，并且活性、耐受性均有明 顯的提尚。
[0042] 一個實施方式的突變型TaqDNA聚合酶包括：
[0043] (a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0044] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0045] (c)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0046] 特別的，野生型TaqDNA聚合酶包括與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多 核苷酸具有至少99%同源性的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0047] 另一實施方式的突變型TaqDNA聚合酶包括：
[0048] (a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0049] (b)、與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽； 或
[0050] (c)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。
[0051] 特別的，野生型TaqDNA聚合酶包括與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多 肽具有至少99%同源性的多肽。
[0052] 由于同一氨基酸可由幾種不同的密碼子來決定，故同一氨基酸可對應不同的核苷 酸序列。因此本申請中的突變型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列，包括SEQIDN0. 2所示的 氨基酸序列，除可由SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列所編碼，也可由SEQIDNO. 1所示核苷 酸序列進行1個或幾個核苷酸取代而得到的密碼子同義突變的核苷酸序列所編碼得到。本 領域技術人員可以根據本申請公開的突變型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列，根據現有分子 生物學技術，采用cDNA克隆和定點突變的方法或其他適合的方法獲得本申請的突變型Taq DNA聚合酶，因此，編碼上述突變型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列并不僅限于SEQIDNO.