參與西瓜葫蘆素e合成的基因簇及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及參與西瓜萌蘆素E合成 的基因簇及其應用。
【背景技術】
[0002] 西瓜的苦味是由一類稱為萌蘆素E的三萜化合物導致的。西瓜果實中積累萌蘆素 E會嚴重影響西瓜的口感及品質。前期研究利用基因組學、分子生物學、生物化學等手段揭 示了由9個基因參與的黃瓜苦味物質萌蘆素C的合成途徑，其中包括1個氧化角鯊烯環化 酶Bi，7個細胞色素P450基因和1個乙酰基轉移酶基因，并利用生物化學方法完全闡明了 四步反應，其對于萌蘆科植物中其他類型的萌蘆素生物合成路徑的研究具有重要的指導意 義，也為植物中其他三萜化合物的通路解析提供了新思路。萌蘆素具有抗蟲作用，并且醫學 研究證明萌蘆素能夠抑制多種癌細胞生長，目前萌蘆素主要從植物中提取獲得，不能通過 異源生物合成。而西瓜中參與萌蘆素E生物合成的基因還沒有被克隆，萌蘆素E生物合成 路徑的解析將為開發新型抗癌藥物提供基礎。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇及其應用。
[0004] 為了實現本發明目的，本發明提供參與西瓜萌蘆素E合成的蛋白，包括 Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它們的氨基酸序列分別如SEQIDNo. 1-8所示。
[0005] 本發明還提供參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇，所述基因簇由以下8個基因組 成，Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它們的核苷酸序列分別如SEQIDNo. 10-17所示。
[0006] 本發明還提供含有所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇的載體、工程菌及宿主細 胞。
[0007] 本發明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在調控西瓜苦味合成中的應 用。
[0008] 本發明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在調控萌蘆素體外合成中的 應用。
[0009] 本發明還提供所述參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇在無苦味西瓜分子育種中的 應用。
[0010] 前期研究中利用基因組學、分子生物學、生物化學等手段揭示了由9個基因參與 的黃瓜苦味物質萌蘆素C的合成途徑，以此為基礎，通過將西瓜中的環化酶基因與黃瓜中 的氧化角鯊烯環化酶基因Bi進行進化樹分析，找到了一個與黃瓜Bi基因同源性最高的基 因Cla007080(Bi)，利用酵母表達體系證明了該基因編碼萌蘆二烯醇合成酶，是萌蘆素合 成的關鍵酶。萌蘆二烯醇還需要進一步被氧化和乙酰化才能生成萌蘆素。為了解析萌蘆 素E合成的其他步驟，利用比較基因組學方法在西瓜基因組中找到了一個類似于黃瓜萌 蘆素C合成的基因簇：由 6 個P450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082、 Cla008354 和Cla008355)、l個乙酰轉移酶基因（Cla007081)和 1 個Bi基因（Cla007080) 組成。這8個基因在西瓜各個組織中的表達狀態非常相似，只在根中大量表達。此外，除了 基因Cla008354和Cla008355以外，其他基因與Bi基因均位于6號染色體57kb的范圍內， 形成一個類似基因簇的結構。目前，以基因簇的形式參與重要次生代謝產物合成在高等植 物中被廣泛發現，因此推測這8個候選基因很可能參與了萌蘆素E的合成。
[0011] 進一步利用酵母表達體系，在酵母中表達這些候選基因，用UPLC-Q-T0F儀分析 產物的精確分子量，推測可能發生的氧化反應產物，解析萌蘆素E合成中間步驟。首 先，在表達Bi、還原酶CPR和Cla008354的酵母中發現了兩個特異產物，一個分子量為 441. 3727[M+H]，另一個為 457. 3676[M+H]，經過MS、MS/MS結果分析推測Cla008354 為多 功能P450,在萌蘆二烯醇合成中先羰基化，再羥基化。進一步將該產物從酵母中純化分 離出來，利用核磁共振（NMR)解析其結構，發現萌蘆二烯醇的11號碳原子先發生羰基化 (C3QH4S02)，然后在20號碳原子上發生羥基化（C3(]H4S03)，進而證Cla008354可連續氧化萌蘆 二烯醇，催化萌蘆素E合成的第二步和第三步。由于基因Cla008354與Cla008355高度同 源，經過相同的方法驗證基因Cla008355也具有相同的功能，即也能夠催化萌蘆二烯醇的 11號碳原子先發生羰基化（C3(]H4S02)，然后在20號碳原子上發生羥基化（C3(]H4S03)。繼續利 用酵母表達體系，表達更多的候選基因，利用類似的方法，僅在表達Bi、CPR、Cla008354 (或 Cla008355)和Cla007079的酵母提取物中發現分子量為473. 3625[M+H]的特異產物，推 測上一步催化產物被Cla007079羥基化，進一步將該產物從酵母中純化分離出來，利用 核磁共振（NMR)解析其結構，發現在2號碳原子上發生了羥基化（C3(]H4S04)，進而證明了 Cla007079催化萌蘆素E合成的第四步。
[0012] 本發明首次在西瓜基因組中發現參與萌蘆素E合成的基因簇，共由8個基因組成， 其中6個基因均位于6號染色體57kb的范圍內。利用酵母體系成功解析了萌蘆素E合成 的第1至第4步反應。本發明進一步揭示了西瓜苦味形成的分子機制，為無苦味西瓜育種 提供了理論依據和分子輔助育種目標，可用于大規模篩選育種材料，大大加快高品質西瓜 的育種進程；同時還為萌蘆素的體外人工合成提供了寶貴經驗，本發明可替代傳統的從植 物材料中提取苦味素（萌蘆素）的方法，利用合成生物學從而實現體外合成苦味素。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明通過比較基因組學以及RNA-Seq數據分析，從西瓜基因組中發現與 苦味素（萌蘆素E)合成相關的基因簇。
[0014] 圖2為本發明利用UPLC-Q-T0F檢測參與苦味素合成第二步和第三步反應的結果； 其中，A為UPLC-Q-T0F檢測到的Cla008354和Cla008355的特異產物，B為該特異產物的 MS/MS檢測結果，C為核磁共振NMR結構解析結果。
[0015] 圖3為本發明利用UPLC-Q-T0F檢測參與苦味素合成第四步反應的結果；其中，A 為UPLC-Q-T0F檢測到的Cla007079的特異產物，B為該特異產物的MS/MS檢測結果，C為核 磁共振NMR結構解析結果。
【具體實施方式】
[0016] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0017] 實施例1參與西瓜萌蘆素E合成的基因簇的挖掘與獲得
[0018] 1、基因簇的挖掘
[0019] 以黃瓜苦味物質萌蘆素C合成基因簇研究為基礎，利用比較基因組學方法，在西 瓜基因組中找到了一個類似于黃瓜萌蘆素C合成的基因簇，共找到8