一種球孢白僵菌dsxj-07及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種球孢白僵菌菌株DSXJ-07,及其該菌 株用于防治農作物害蟲的應用。
【背景技術】
[0002] 稻水象甲（LissorhoptrusoryzophilusKuschel)屬鞘翅目，象蟲科，沼澤象亞 科，稻水象屬。主要危害水稻并以玉米、甘蔗、小麥、大麥、牧草、禾本科雜草等為寄主，具有 危害時間長，繁殖傳播速度快，抗藥性和抗逆性強等特點。成蟲啃食稻葉，幼蟲蛀食稻根，一 般造成水稻減產15%~20%，嚴重的減產50%以上，甚至絕收，是水稻上重要檢疫性害蟲， 被國際自然保護聯(lián)盟列為全球100種最具威脅性的外來入侵生物之一。1986年我國將其列 為對外檢疫對象。此蟲原產地為美國。上世紀70年代初，孤雌生殖型稻水象甲傳入亞洲。 1976年，在日本愛知縣首見此蟲，至1983年，此蟲幾乎蔓延遍及日本全境。1988年，由日本 傳入韓國及朝鮮。我國于1988年在河北省唐?？h首次發(fā)現(xiàn)稻水象甲。此后，稻水象甲在我 國迅速蔓延，截至2011年底已在我國20個省市自治區(qū)發(fā)現(xiàn)了稻水象甲危害。稻水象甲已 經成為我國水稻生產的一大潛在威脅，我國將其列為近年來重點加強防治的5個外來入侵 生物之一。
[0003] 玉米已成為我國的第一大糧食作物（2012年起），作為主要的糧食作物、飼料作物 和加工工業(yè)的重要原料，在發(fā)展國民經濟中具有重要地位。玉米螟是玉米的主要害蟲，一 般發(fā)生年份引起玉米減產10%，大發(fā)生年減產可達30%。玉米螟危害成為限制我國玉米產 量的主要因素之一。
[0004] 長期以來，我國主要依賴于化學農藥防治以上兩種害蟲，由于化學殺蟲劑的大量、 連年施用，使農產品、土壤和水域受到農藥殘留污染，對人類健康已構成嚴重威脅和損害； 害蟲抗藥性的增強，使得用藥量不斷增加，防治費用倍增；有益天敵生物被大量損傷，生態(tài) 環(huán)境遭到嚴重破壞，導致害蟲的再增猖獗。為保護生態(tài)環(huán)境，保證食品和飼料的產量、品質 和安全性，應用生物防治技術大面積控制農業(yè)害蟲，采取害蟲可持續(xù)治理措施勢在必行。
[0005] 昆蟲病原真菌是最重要的殺蟲微生物類群，在自然條件下約70 %的昆蟲病害是 真菌引起的。其致病機制復雜，不會引起害蟲產生抗性，對解決害蟲的抗藥性問題極具潛 力。因此，昆蟲病原真菌作為重要的替代農藥，近年來受到廣泛關注。在我國，球孢白僵 菌和綠僵菌已被廣泛應用于亞洲玉米螟（OstriniafurnacalisGuen6e)、飛幢（Locusta miratoria)和松毛蟲（DendrolimuspunctatusWalker)等多種大田及林業(yè)害蟲的防治，并 取得了顯著的經濟、社會和生態(tài)效益。截止到2007年，世界上先后有180余種真菌殺蟲劑 問世。昆蟲病原微生物是唯一通過穿透昆蟲體壁主動侵入昆蟲的微生物，是鞘翅目和刺吸 式害蟲的最有效的生物防治手段。另外，昆蟲病原真菌具有較強的垂直和水平擴散能力，有 助于害蟲的持續(xù)控制，對于迀飛性害蟲稻水象甲的控制尤為有力，利用殺蟲真菌控制稻水 象甲雖已見到相關報道，但殺蟲效果均不理想，其主要原因之一是缺乏對稻水象甲具有高 毒力的昆蟲病原真菌菌株。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種對稻水象甲及亞洲玉米螟兩種害蟲均有防治效果，且 防治效果及生產性狀均良好的球孢白僵菌菌株DSXJ-07,利用該菌株生產的殺蟲真菌制劑， 能夠大幅度提高對稻水象甲及亞洲玉米螟的防治效果。
[0007] 本發(fā)明具體通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明提供的一種球孢白僵菌（beauveriabassiana)DSXJ_07,該菌株已進行保 藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號；保藏日期：2013年01月23日；藏編號：CGMCCNo. 7192。
[0009] 本發(fā)明所述的球孢白僵菌DSXJ-07的內轉錄間隔區(qū)的序列為SEQIDNo. 1。
[0010] 本發(fā)明球孢白僵菌DSXJ-07接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初期菌落呈白色絨毛狀至 棉絮狀，產孢后變成淡黃色；菌絲透明，具有分隔和分支，直徑為3. 0-3. 5ym;分生孢子梗 濃密簇生、輪生或單生，呈帚狀分支，大小2. 5~5. 5X1. 5~2. 5ym，其末端產生瓶形小梗， 大小15. 5~25. 5X1. 5~3. 0ym;從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子，分 生孢子為單細胞，呈球形或近球形，大小2~3X2~2. 5um。
[0011] 本發(fā)明球孢白僵菌DSXJ-07用于防治禾本科作物上害蟲的應用。所述的禾本科作 物為水稻、玉米、甘蔗、小麥、大麥或牧草，所述的害蟲為稻水象甲和亞洲玉米螟。
[0012] 本發(fā)明球孢白僵菌菌株DSXJ-07作為制備防治禾本科作物害蟲生物農藥的應用， 通過常規(guī)的液固雙相發(fā)酵生產，獲得白僵菌高孢粉，然后加入表面活性劑如分散劑、穩(wěn)定 劑、濕潤劑、粘結劑、消泡劑、崩解劑、抗凍劑等中的一種或幾種，或吸附載體按一定比例混 合后，制備成可濕性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、懸乳劑、水乳劑或微乳劑；所述的禾本科作 物為水稻、玉米、甘蔗、小麥、大麥或牧草，所述的害蟲為稻水象甲及亞洲玉米螟。
[0013] 本發(fā)明球孢白僵菌菌株DSXJ-07防治禾本科作物上害蟲的方法也屬于本發(fā)明 的保護范圍，該方法是在植物生長過程中進行噴霧處理；所述噴霧為球孢白僵菌菌株 DSXJ-07的菌懸液或發(fā)酵液或代謝產物或制備的農藥制劑。
[0014] 本發(fā)明的有意效果為：本發(fā)明從自然感染的稻水象甲僵蟲直接分離篩選的球孢白 僵菌菌株DSXJ-07,產孢能力強、其生產性狀好、生長迅速；同時對稻水象甲及亞洲玉米螟 殺蟲活性強、對稻水象甲成蟲及亞洲玉米螟3齡幼蟲的LT9。值分別為（5. 10±0. 11)天和 (6. 07±0. 52)天。利用該菌株生產的殺蟲真菌制劑，可有效控制稻水象甲及亞洲玉米螟的 種群數(shù)量。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內容，依據(jù)本發(fā)明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內。
[0016] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0017] 實施例1球孢白僵菌菌株DSXJ-07的分離與鑒定
[0018] 將采集到的自然感染的稻水象甲僵蟲先用75 %酒精浸沒3~5s，再用0.5% NaCIO表面消毒3min，滅菌水沖洗3次，在無菌條件下，用滅菌刀具將感染蟲體切成5mm見 方小塊，置于9cmPDA平板上培養(yǎng)，放入28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天，使其昆蟲表面生長出 新鮮孢子；然后用接種環(huán)挑取新鮮孢子在含有50yg/ml頭孢霉素和30yg/ml卡那霉素的 PDA平板上劃線；將劃線好的培養(yǎng)皿倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3~4日后挑選出典型而 無雜菌的菌落，在菌落邊緣用接種環(huán)挑取帶有菌絲的一小塊培養(yǎng)基，轉入平板培養(yǎng)基中央， 28°C培養(yǎng)10~15天，待產孢后，轉移至斜面培養(yǎng)基，獲得球孢白僵菌菌株DSXJ-07,4°C保 藏。
[0019] 1)形態(tài)鑒定
[0020] 將分離到的球孢白僵菌DSXJ-07菌株接種在PDA平板上，28°C培養(yǎng)觀察菌落形態(tài) 特征、產孢結構和孢子形狀與大小。
[0021] 結果顯示在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落呈白色絨毛狀至棉絮狀，產孢后變成淡 黃色；菌絲透明，具有分隔和分支，直徑為3. 0-3.5ym;分生孢子梗濃密簇生、輪生或單 生，呈帚狀分支，大小2. 5~5. 5X1. 5~2. 5ym，其末端產生瓶形小梗，大小15. 5~ 25. 5X1. 5~3. 0ym;從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子，分生孢子為單 細胞，呈球形或近球形，大小2~3X2~2. 5umiim。
[0022] 2)球孢白僵菌菌株DSXJ-07的ITS序列擴增、序列測定及分子鑒定
[0023] 將球孢白僵菌DSXJ-07菌株在SDAY液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)3天（200rpm，28°C)。 4°C，10000rpm離心20min，以收集菌絲。液氮研磨破碎后采用真菌基因組DNA提取 試劑盒提取球孢白僵菌DSXJ-07的基因組總DNA。以提取得到的總DNA為模板，參照 White設計引物擴增球孢白僵菌ITS1-5. 8S-ITS2rDNA區(qū)域。所用引物為ITS15' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3' 和ITS45' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'，產生 550bp擴增產 物。擴增條件：94°C預變性4min，l個循環(huán)；94°C變性lmin，53°C退火0. 5min，72°C延伸45s， 35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。采用凝膠回收試劑盒回收擴增產物，交由生工生物工程 (上海）股份有限公司采用雙脫氧測序法測定擴增產物序列。球孢白僵菌DSXJ-07ITS1 - 5. 8S-IT