綴合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫檢測領域，特別是涉及一種綴合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 梅毒是一種慢性系統性傳染病，其病原體是梅毒螺旋體，亦稱蒼白螺旋體 (Treponema pallidum, TP)，主要通過性接觸和血液傳播。梅毒可產生多種多樣的癥狀和體 征，且時隱時顯，病程可持續很長，幾乎可侵犯全身各器官，是僅次于艾滋病的嚴重危害我 國人民身體健康的性傳播疾病。近年來梅毒發病率在我國有上升的趨勢，據2014年梅毒重 點疫情報告，2009年以來梅毒位于乙類傳染病報告發病數的第三，尤其是在產前門診篩查 出的梅毒抗體陽性的孕婦顯著增加，給我國的公共衛生帶來危害。
[0003] 目前，國內外對梅毒的發病機制和診斷方式進行了大量的研究，梅毒的診斷和治 療后效果評價一直是利用體液免疫學指標。我國對血源篩選部分采用快速血漿反應素環 狀卡片試驗（rapid plasma reagin，RPR)和甲苯胺紅不加熱血清試驗（tolulized red unheated serum test, TRUST)方法，RPR和TRUST的主要缺點是敏感性和特異性不高，許多 非梅毒性疾病，如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、慢性迀延性肝炎等均可呈陽性反應。 另外一種方法，熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗和梅毒螺旋體血凝試驗雖然可提高檢測的特 異性，但是需制備大量病原體，且質量難以控制，也不利于大規模的血液篩查工作。因此，研 制快速、簡便、靈敏且特異的診斷試劑是當前的主要任務。
[0004] 免疫檢測（immunoassay, IA)是應用免疫學技術測定標本，通過抗原抗體反應檢 測體液中的抗體或抗原性物質，是一種敏感的測定的方法。抗原抗體反應后直接測定形成 的沉淀或濁度，敏感度可達5-10 iig/mL。但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低 于這一水平，導致檢測受限。目前市場上大多梅毒檢測產品采用標記法，將檢測試劑中的抗 原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物可提高敏感度。標記物有多種，包 括酶、化學發光物質、熒光物質、放射性物質等，均可提高免疫檢測的靈敏度，比直接測定沉 淀物提高數百至數千倍，達到肉眼可分辨的水平或者機器可讀出的水平。在免疫檢測時，為 了提高靈敏度，標記比例越高越好，但是，標記比例提高會影響抗原活性。
【發明內容】
[0005] 基于此，有必要提供一種標記比例提高并且不影響抗原活性的綴合物，以及其制 備方法和應用。
[0006] 一種綴合物，其特征在于，包括融合蛋白和標記物，所述融合蛋白包括梅毒檢測抗 原以及嵌合在所述梅毒檢測抗原的N端的輔助蛋白，所述標記物標記在所述輔助蛋白上。
[0007] 在一個實施例中，所述梅毒檢測抗原為梅毒螺旋體抗原。
[0008] 在一個實施例中，所述輔助蛋白為大腸桿菌周質蛋白。
[0009] 在一個實施例中，所述大腸桿菌周質蛋白包括：
[0010] (a)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0011] (b)、與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少90%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0012] (c)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0013] 在一個實施例中，所述大腸桿菌周質蛋白包括：
[0014](a)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0015](b)、與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少90%同源性的多肽； 或
[0016] (c)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。
[0017] 在一個實施例中，所述標記物為酶、化學發光物質、熒光物質、放射性物質和膠體 中的至少一種。
[0018] -種上述綴合物的制備方法，包括如下步驟：
[0019] 步驟一、提供基因表達載體，所述基因表達載體用于表達融合蛋白，所述融合蛋白 包括梅毒檢測抗原以及嵌合在所述梅毒檢測抗原的N端的輔助蛋白；
[0020] 步驟二、將所述基因表達載體轉化到宿主細胞中，所述宿主細胞為原核細胞；
[0021] 步驟三、對轉化了所述基因表達載體的所述宿主細胞進行誘導表達，分離得到表 達液；
[0022] 步驟四、在所述表達液中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20%，充分靜止后 收集上清，接著在所述上清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為40%，充分靜止后收集 沉淀，將所述沉淀重新溶解，得到粗產物；
[0023] 步驟五、利用Ni-NTA親和柱純化所述粗產物，得到所述融合蛋白；
[0024] 步驟六、對所述融合蛋白進行標記，使得標記物標記在所述輔助蛋白上，得到所述 綴合物。
[0025] -種梅毒檢測試劑，包括上述綴合物。
[0026] -種梅毒檢測試劑盒，包括上述梅毒檢測試劑。
[0027] 上述綴合物在制備梅毒診斷試劑領域中的應用。
[0028] 這種綴合物中，輔助蛋白嵌合在梅毒檢測抗原的N端，標記物標記在輔助蛋白上， 避免了標記物與抗原直接作用。與傳統的試劑相比，該綴合物隨標記比例提高，抗原不會被 標記物包裹，避免了抗原決定簇與標記物結合造成的抗原活性降低，從而不會影響抗原活 性，檢測時可適當提尚標記物的比例，進而提尚檢測的靈敏度和特異性。
【附圖說明】
[0029] 圖1為一實施方式的綴合物的制備方法的流程圖；
[0030] 圖2為一實施方式的基因表達載體的構建過程。
【具體實施方式】
[0031] 下面主要結合附圖及具體實施例對綴合物及其制備方法和應用做進一步的解釋 說明。
[0032] 本發明中使用的術語除非另有說明，否則具有以下含義：
[0033] 綴合物
[0034] 本發明中使用的術語"綴合物"包括融合蛋白和標記物，融合蛋白包括梅毒檢測抗 原以及嵌合在梅毒檢測抗原的N端的輔助蛋白，標記物標記在輔助蛋白上。
[0035] 融合蛋白
[0036] 本發明中使用的術語"融合蛋白"是指輔助蛋白嵌合在梅毒檢測抗原的N端形成 的蛋白。
[0037] 標記物
[0038] 本發明中使用的術語"標記物"是指免疫檢測中可被檢測到的物質，具體的，標記 物可以為酶、化學發光物質、熒光物質、放射性物質、膠體中的至少一種。
[0039] 在傳統的免疫檢測時，由于標記物直接標記在抗原上面，其存在的固有缺陷是：為 了提高靈敏度，標記比例越高越好，但是比例過高會使抗原被更多的標記物包裹，抗原表位 被包埋，導致抗原活性降低，因此為了兼顧抗原活性標記比例無法無限制提高，造成靈敏度 提高有限。本發明發現，在梅毒檢測抗原的N端嵌合輔助蛋白可以有效的解決上述問題。
[0040] 因此，本發明提供一種綴合物，包括融合蛋白和標記物，融合蛋白包括梅毒檢測抗 原以及嵌合在梅毒檢測抗原的N端的輔助蛋白，標記物標記在輔助蛋白上。
[0041] 綴合物中的標記物標記在輔助蛋白上，避免了標記物與抗原直接作用，因此不會 影響抗原活性，檢測時可適當提高標記物的比例，進而提高檢測的靈敏度和特異性。
[0042] 具體的，梅毒檢測抗原可以為梅毒螺旋體抗原。在一個實施方式中，梅毒檢測抗原 為梅毒螺旋體 17Kda(TpN17)基因（GeneBank No :M74825)的 63aa ~156aa 所對應的 DNA 區段表達得到的梅毒螺旋體抗原。
[0043] 在其他實施方式中，梅毒檢測抗原還可以選擇其他種類的梅毒螺旋體抗原。
[0044] 具體的，輔助蛋白可以為大腸桿菌周質蛋白。
[0045] 大腸桿菌周質蛋白（0SMY)能促進蛋白溶解性及細胞定位，而周質中的氧化環境 有利于蛋白質的正確折疊，明顯提高目的蛋白可溶部分比例及活性。通過梅毒螺旋體抗原 與大腸桿菌周質蛋白融合表達，得到的融合蛋白可溶性增強，蛋白活性高。另外，經分子生 物學軟件分析，0SMY等電點為酸性，親水性較好，賴氨酸含量較高，且分布均勻，利于標記物 的標記。
[0046] -實施方式中，大腸桿菌周質蛋白包括：
[0047] (a)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0048] (b)、與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少90%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0049] (c)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0050] 特別的，大腸桿菌周質蛋白包括與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷 酸具有至少99%同源性的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0051] 另一個實施方式中，大腸桿菌周質蛋白包括：
[0052](a)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0053](b)、與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少90%同源性的多肽； 或
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