抗人白介素-6受體β鏈單克隆抗體、其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，尤其涉及一種單克隆抗體，具體來說是一種抗人白介 素-6受體3鏈單克隆抗體及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 分子量為130kD，其細胞外部由6個連續的0片層結構域組成，分別為免疫球蛋 白樣結構域（功能域1)，CHR分子（功能域2,功能域3)及3個纖連蛋白III樣結構域（功 能域4-6)，不同的結構域在配體連接及信號轉導中均發揮重要作用。白介素-6受體@鏈 作為白介素-6家族細胞因子-白介素_6,細胞抑制因子（LIF)、抑癌素M(OSM)、睫狀神 經營養因子（CNTF)、白介素-11、心肌營養因子l(cardiotrophin-l)及白介素-27的共受 體，通過介導不同炎癥因子的信號轉導而參與到多種疾病中，例如在類風濕性關節炎（RA)， 巨大淋巴增生病，炎癥性腸病，多發性骨髓瘤，銀屑病，糖尿病，哮喘，肥胖及腫瘤等疾病的 發生發展中扮演重要角色。隨著研究的深入，人們逐漸關注到白介素-6受體0鏈相關信 號通路可能會成為臨床免疫干預和治療的新靶點。2009年在美國舉行的國際抗體會議已有 研究者報告和提出白介素-6受體P鏈的診斷和治療性抗體具有良好的應用前景，因此無 論是從免疫藥理還是藥物開發角度，針對白介素-6受體3鏈系統中白介素_6受體3鏈、 其相應配體或信號轉導相關蛋白的調控分析都是目前研究熱點。
[0003] 白介素_6是白介素-6受體0鏈的重要配體之一，與慢性炎癥性疾病、自身免疫 性疾病及腫瘤等的發生密切相關。白介素-6受體包括特異性白介素-6受體a鏈（gp80) 及白介素-6受體P鏈（gpl30)。白介素-6受體ct鏈的表達主要局限于肝細胞，白細胞 亞群，巨核細胞等細胞表面，而白介素-6受體3鏈則表達于所有細胞表面。白介素_6通 過傳統途徑及反式信號途徑兩種方式向細胞內傳導信號。經典途徑中白介素-6先與膜連 接白介素_6受體a鏈結合，之后誘導白介素-6受體3鏈同源二聚化，形成高親和力白介 素-6/白介素-6受體a /白介素-6受體0鏈復合體，從而進行信號轉導。反式途徑中可 溶性形式的游離白介素-6受體a鏈與白介素-6結合后直接與白介素-6受體3鏈形成 復合體，因此在不表達膜連接白介素-6受體a鏈的細胞仍可通過白介素-6起反應。研究 者認為游離白介素-6受體a鏈及反式信號的存在使得白介素-6成為參與炎癥過程中最 為重要的細胞因子之一，其參與多種自身免疫疾病及腫瘤的發生發展，尤其是白介素-6在 類風濕性關節炎中的作用機制，一直是臨床研究的熱點。
[0004] 類風濕性關節炎是一種以滑膜增生及關節進行性破壞為特征的自身免疫性疾病， 在我國的發病率約為0.4% -1.0%，重癥類風濕性關節炎患者最終罹患以四肢關節為主的 全身各關節嚴重損傷，致殘率高達15%。傳統制劑甲氨蝶呤、來氟米特等藥物的針對性不 強，療效常常不盡如人意。近年來免疫學新的干預手段與臨床經典治療方法的協同對于抑 制類風濕性關節炎的發生、發展起到了一定效果。現今進入臨床前或臨床研究的治療類風 濕性關節炎相關免疫抑制劑主要可分為兩大類：1)細胞因子干預制劑：主要是腫瘤壞死因 子（TNF)阻斷劑（阿達木單抗等）、白介素-6受體a鏈阻斷劑（塔西單抗TCZ) ;2)蛋白激 酶抑制劑：如JAK抑制劑、SYK抑制劑。然而由于類風濕性關節炎患者的個體化差異，對現 有的生物制劑反應不一，大部分患者還是經歷了從骨關節炎癥向類風濕性關節炎發展，最 終罹患嚴重的關節損傷而致殘。因此亟需我們繼續深入研究類風濕性關節炎的發病機制， 研制新的藥物靶點。
[0005] 大量研究表明：白介素_6信號系統與類風濕性關節炎存在密切關聯性。類風濕性 關節炎患者血清及滑液中白介素-6及游離白介素_6受體鏈a的濃度升高，且白介素-6 水平與疾病活動性因子（類風濕因子，血沉，C反應蛋白）的表達水平，類風濕性關節炎患 者臨床表現（如X線改變，受累關節數量，晨僵的持續時間）密切相關。緩解關節骨破壞是 治療類風濕性關節炎患者最關鍵問題，而破骨細胞比例增高被認為是類風濕性關節炎患者 骨關節損害的重要因素。類風濕性關節炎患者中相關炎癥細胞因子激活破骨細胞前體細胞 的增殖分化，破骨細胞生成比例增高，造成患者骨代謝失衡，而白介素-6信號系統在對破 骨細胞調控中發揮著重要作用。
[0006] 已有研究工作證明：抑制白介素-6過表達或白介素-6信號系統異常的拮抗劑可 有效地調控白介素-6介導的免疫紊亂性疾病。臨床研究顯示，針對白介素-6信號系統的 拮抗劑，在一定程度上能緩解類風濕性關節炎患者/類風濕性關節炎樣動物模型的發病進 程。以白介素-6為靶點的拮抗劑（如lokizumab)，由于抗白介素-6抗體結合游離的白介 素-6不能從體循環中被清除，然而發生白介素-6堆積（近毫克水平）所帶來的副作用，一 直限制和阻礙了其在的臨床廣泛應用。以白介素-6受體鏈a為靶點的單抗藥物塔西單抗 是唯一通過臨床III期試驗的白介素-6信號通路相關生物制劑。臨床實驗中，類風濕性關 節炎患者使用塔西單抗治療后，可觀察到患者疾病活性指標顯著持續性降低，局部關節癥 狀及體征改善明顯，C反應蛋白快速恢復至正常水平，并且對有些腫瘤壞死因子治療無效的 患者有高反應性，因此被認為是晚期類風濕性關節炎患者的有效治療手段。然而深入研究 發現塔西單抗同時作用于經典信號以及反式信號，全面阻斷了白介素-6的活性，因而也帶 來了一系列的副作用，如感染的發生，血中谷丙轉氨酶水平升高，血總膽固醇、高密度脂蛋 白及低密度脂蛋白水平升高，心血管疾病發生風險增加等，也因此阻礙了其在臨床上的廣 泛應用。另一種以游離白介素6受體鏈0為靶點的單抗制劑（sgpl30)，由于在體內會形成 大量聚集物，目前僅停留在實驗研究。
[0007] 考慮到白介素_6信號在類風濕關節炎中的多重作用及白介素-6受體鏈a的單 克隆抗體（塔西單抗）對TNF拮抗劑無效患者、晚期類風濕性關節炎患者的改善作用，抗人 白介素_6受體鏈P功能域單抗的研制可能成為治療類風濕性關節炎患者新手段。隨著 白介素_6受體P鏈與其配體的偶聯位點的進一步明確，并證實白介素_6家族不同細胞 因子需通過與各自的特有受體連接后再與白介素-6受體鏈0不同的結構域結合而發揮 功能，抗白介素-6受體P鏈不同功能域的單克隆抗體具有不同的生物學功能，也使制備白 介素-6受體P鏈單一配體信號的拮抗劑成為可能，并有望為治療單抗藥物的研發提供有 力工具。為了驗證上述科學問題，我們通過抗膠原II功能域抗體誘導建立類風濕性關節炎 樣小鼠模型（collagen antibody induce arthritis, CAIA)，結果表明抗人白介素-6受體 3鏈單抗能抑制模型小鼠的疾病發生發展，維持小鼠骨平衡等；應用鼠抗人/抗鼠的單克 隆抗體，分析其針對抗人白介素-6受體3鏈單抗不同功能域和表位的效價、競爭抑制、親 和力和針對不同抗原靶點的生物學特性；完成了針對鼠抗人/抗鼠的單克隆抗體進行全基 因測序；初步揭示了上述單抗調控類風濕性關節炎樣模型小鼠發病與轉歸的免疫病理學機 制；同時應用已建立的類風濕性關節炎患者病灶滑膜滑膜成纖維細胞細胞介導破骨細胞前 體細胞向破骨細胞分化技術，初步闡明了抗人白介素-6受體0鏈單抗調控類風濕性關節 炎患者免疫學功能紊亂和骨代謝失衡的實質表明本專利申請的抗人白介素-6受體3鏈單 抗的有效生物學活性和具有干預類風濕性關節炎患者發病的潛在臨床應用前景。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述科學和技術問題，本發明提供了一種抗人細胞表面或血清游離的單 克隆抗體，所述抗體分子Fab段抗原結合部位的輕鏈可變區的cDNA及氨基酸序列如下所 示，重鏈可變區的cDNA及氨基酸序列如下所示。
[0009] 所沭抗人白介素-6夸體13鏈單克降抗體分子的cDNA及氨某酸序列如下，并分別 對應序列表中的序列1、2、3和4 :
[0010] 輕鏈可變區(cDNA序列1和氨某酸序列2):
[0011]
[0013] 重鏈可奪區（cDNA序列