替換ipq表位的重組蛋白及其編碼核苷酸和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及GPC3-HBsAg重組蛋白及其編碼核苷酸和應 用。
【背景技術】
[0002] 磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican)家族是存在于細胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白 多糖的新家族。迄今已報告有五種磷脂酰肌醇蛋白聚糖（磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰 肌醇蛋白聚糖2,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖4,和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5) 是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員。該家族的成員有大小均一（約60kDa)的核心蛋白，共 有特異、高度保守的半胱氨酸序列，并通過糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨定結合到細胞膜上。
[0003]Motomura等人發現GPC3在小鼠體內可誘導出GPC3特異性的抗腫瘤免疫，但GPC3 不會在小鼠體內導致自身免疫疾病的發生。同時發現，具有GPC3特異性的殺傷性T細胞 (CTL)可以向表達GPC3的腫瘤組織發生定向迀移，而不引起自身免疫性的破壞。因此，GPC3 誘導的特異性CTL定向移動發揮抗腫瘤免疫作用可以作為治療HCC及黑色瘤的一種可能手 段。并通過實驗證實CTL表位可在小鼠體內被CTL所識別并誘導特異性的細胞免疫，該發 現對以GPC3為靶點的腫瘤免疫治療有重要的意義。
[0004]HBsAg疫苗與傳統的疫苗相比具有如下優點：1.無需免疫佐劑，即能誘導出高效 而特異的細胞免疫和體液免疫；2.HBsAg本身不能復制，也無感染性；3.HBsAg在體外能被 大量擴增，并易于濃縮和純化。上述特點表明，HBsAg具有減毒活病毒疫苗的免疫原性，但 無其缺點。以特異性的外源抗原（基因）插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特 異性的內源CTL表位能否在體內誘導出高效而特異的細胞免疫，越來越成為疫苗研究的熱 點。現已證明，在保留其有效的包裝蛋白表位基礎上，在HBsAg基因開放性閱讀框架（open readingframe，0RF)上定位突變掉內源性CTL表位并建立核酸內切酶酶切位點，構建好 的重組質粒允許插入一個或多個外源表位，在保留HBsAg部分生物學和免疫學特性的基礎 上，還能保證外源性表位具有免疫活性。
[0005] 非專利文獻王文敬等，GPC-3CTL表位表達載體構建，南方醫科大學學報，2009， 29 (8)，1548-1550 ;公開了 一種構建編碼GPC3-HBsAg重組蛋白表達載體，其采用GPC3的 CTL表位分別替換HBsAg中的FLG、LLD和SIL表位而獲得表達載體，并具有一定免疫原性。 但是，本領域中HBsAg存在多個CTL表位，替換的表位不同，免疫原性相差較大，因此選擇合 適的HBsAg的CTL表位用于替換，對獲得的重組蛋白的免疫原性具有決定性的影響。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一方面是提供一種GPC3_HBsAg重組蛋白，其以重組的乙肝表面抗原 (HBsAg)為分子骨架，利用外源CTL表位替換HBsAg內源性CTL表位；所述其他外源CTL表 位為GPC3的CTL表位。
[0007] 在本發明的一個優選實施方案中，在所述重組的乙肝表面抗原（HBsAg)中，一個、 二個、三個或更多個HBsAg內源性CTL表位被一個、二個、三個或更多個GPC3的CTL表位所 替換。
[0008] 在本發明的另一個實施方案中，所述重組的乙肝表面抗原（HBsAg)的氨基酸序列 如SEQIDN0 :1所示；在所述SEQIDN0 :1序列中，HBsAg內源性CTL表位相應地被GPC3 CTL表位所替換。
[0009] 在本發明的另一個實施方案中，所述編碼fffisAg內源性CTL表位選自下表中的一 個、二個、三個或更多個表位，具體如表1所示：
[0010] 表1HBsAg蛋白中內源性CTL表位
[0011]
[0012] 在本發明的一個優選的實施方案中，所述HBsAg內源性CTL表位選自包含IPQ表 位的一個或更多個表位，進一步地所述HBsAg內源性CTL表位選自VLQ以及FLL、LLC、LLD、 LLV、SIL和/或LLP表位中的一個、二個、三個或更多個表位。
[0013] 所述GPC3CTL表位選自下表中一個、二個、三個或更多個表位，具體如表2所不：
[0014]表 2GPC3CTL表位
[0015]
[0016] 在本發明的又一個優選的實施方案中，所述GPC3CTL表位選自FVGEFFTDV、 HLGSDINV、FLAELAYDL和 / 或RMLTRMWYC中一個或多個表位。
[0017] 在本發明的又一個優選的實施方案中，所述重組蛋白序列如SEQIDN0 :2所示，其 為采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替換HBsAg內源性CLT表位IPQ、LLD和SIL得到的重組 蛋白。
[0018] 在本發明的又一個優選的實施方案中，所述重組蛋白序列如SEQIDN0 :3所示，其 為采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替換HBsAg內源性CLT表位IPQ和LLD得到的重組蛋白。
[0019] 在本發明的又一個優選的實施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID NO :4所示，其 為采用GPC3 CTL表位FVGEFFTDV替換HBsAg內源性CLT表位IPQ和SIL得到的重組蛋白。
[0020] 在本發明的又一個優選的實施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID N0 :5所示，其 為采用GPC3 CTL表位FVGEFFTDV替換HBsAg內源性CLT表位IPQ得到的重組蛋白。
[0021 ] 本發明的第二方面是提供編碼上述重組蛋白的核苷酸序列。在本領域中，根據上 述重組蛋白的氨基酸序列而獲得編碼核苷酸序列是本領域技術人員已知的，例如，根據密 碼子規則獲得編碼上述重組蛋白的RNA或DNA序列，例如，編碼SEQ ID N0 :1氨基酸序列的 核苷酸序列如SEQ ID N0 :6所示。
[0022] 本發明的第三方面是所述重組蛋白在制備腫瘤疫苗中的應用。
[0023] 本發明的第四方面是所述重組蛋白在制備治療/預防腫瘤藥物中的應用。
[0024] 本發明中所述腫瘤的種類沒有特別限定，優選為表達GPC3的腫瘤，具體選自，包 括但不限于食道癌、乳癌、甲狀腺癌、直腸癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤（黑素瘤）、惡性淋巴 瘤、骨肉瘤、成嗜鉻細胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、腦瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性 白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌或肉瘤等。
【具體實施方式】
[0025] 下面將舉例說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技 術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求 書記載的內容為準。
[0026] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆實 驗指南（Sambrook J，et al. 2008. Molecular Cloning :A Laboratory Manual，3rd Ed.)中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件來進行。
[0027] 實施例1重組HBsAg載體質粒的構建
[0028] 根據基因工程技術，采用PCR定位突變技術對HBsAg基因進行改造，從而獲得一段 改良的HBsAg基因片段，其序列如SEQ ID N0 :6所示，其編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。然后，將上述HBsAg基因片段插入pcDNA3. 1+質粒中，從而獲得重組HBsAg載 體質粒。
[0029] 上述HBsAg基因片段也可以通過合成獲得，并通過PCR技術進行大量擴增。
[0030] 實施例2編碼重組蛋白的DNA分子及表達載體的構建
[0031] (l)SOEing PCR 擴增
[0032] 按照非專利文獻王文敬等，GPC-3 CTL表位表達載體構建，南方醫科大學學報， 2009, 29 (8)，1548-1550公開的方法；以構建好的重組HBsAg質粒為模板，進行SOEing PCR 擴增。
[0033] PCR 反應體系：ddH20 21 yl，5XPCR Buffer 8yl，dNTPs(10mmol/L)lyl，模板 0嫩1111(10〇1^)，引物組（每個引物對的濃度為1〇111]1〇1凡)4111，￡1〇1^386 1111。反應條 件：94°C 5s 預變性，94°C 10s，55°C 20s 循環擴增 25 次，