一種真菌轉化的抗菌化合物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種真菌轉化的抗菌化合物及其制備方法與應 用。
【背景技術】
[0002] 革蘭氏陽性菌傳播范圍極廣，可引起多種感染，是醫院最常見的致病菌，其感染率 也較高。近年來，由于抗生素的濫用等原因，耐藥現象逐年增多，這是造成感染性疾病死亡 率居高不下的主要原因之一。因此，積極開發具有高效、低毒的抗耐藥藥物意義重大。
[0003] 微生物轉化法是利用微生物體系對化合物進行結構修飾，其本質是酶的催化，其 特點是具有高度的立體、位點和區域選擇性，可以將化學合成的外消旋衍生物、前體或潛手 性化合物轉化成手性產物，同時可以對含有多個官能團的復雜天然化合物進行選擇性結構 修飾。因此，可以利用微生物轉化對中藥里含量大的主要活性成分進行結構修飾，獲得新的 活性化合物，既安全有效又可以降低藥物研發成本。
[0004] 狄爾斯一阿爾德反應（Diels-Alder反應）是一種環加成反應，其過程簡單來說就 是共輒雙烯與取代烯烴（一般稱為親雙烯體）反應生成取代環己烯。該反應是在1928年由 德國化學家奧托?迪爾斯和他的學生庫爾特?阿爾德首次發現。狄爾斯一阿爾德反應用很 少的能量就能形成六元環，是碳碳鍵形成的主要反應之一。該反應一次生成兩個碳碳鍵和 最多四個相鄰的手性中心，同時可以大大減少反應步驟，提高了合成的效率，所以在有機合 成中很受重視。然而在自然界中發現的能夠促進[4+2]Diels-Alder環化反應的天然酶蛋白 很少，目前報道Diels-Alder催化酶僅有 5 個（Enzyme_catalysed[4+2]cycloadditionis akeystepinthebiosynthesisofspinosynA. ,Nature, 2011, 473(7345):109-112；The structureofSpnF,astandaloneenzymethatcatalyzes[4+2]cycloaddition,Nature ChemicalBiology, 2015, 11(4) :256-258)，這些酶的結構非常新穎，能夠高效、立體選擇性 催化天然產物反應，從自然界中尋找Diels-Alder酶及其相關的機制的研究長期吸引著眾 多研究者的興趣。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種真菌轉化的抗菌化合物及其制備方法與應用。
[0006] 本發明所提供的化合物，如式I所示：
[0007]
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[0008] 所述化合物或其可藥用鹽在制備抗菌藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0009] 本發明的再一個目的是提供一種抗菌藥物。
[0010] 本發明所提供的抗菌藥物的活性成分為所述化合物或其可藥用鹽。
[0011] 在本發明中，所述抗菌藥物具體為抗革蘭氏陽性細菌的藥物。
[0012] 進一步，所述革蘭氏陽性細菌可為如下中的至少一種：耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌、枯草桿菌、卡介苗和金黃色葡萄球菌。
[0013] 在本發明的實施例中，所述卡介苗具體為牛型結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis)減毒株BCG(Pasteur1173P2);所述金黃色葡萄球菌具體為金黃色葡 萄球菌ATCC6538 ;所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具體為記載于"Gosbell. Methici11in-resistantStaphylococcusaureus.AmericalJournalofClinical Dermatology. 2004, 5 (4) : 239-259. " 一文中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；所述枯草桿菌 具體為枯草桿菌（Bacillussubtilis)ATCC6633。
[0014] 所述抗菌藥物中，所述化合物的質量含量可為0. 1-90%。
[0015] 所述抗菌藥物的藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導 的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機 體。
[0016] 需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載 體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面 活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
[0017] 以所述化合物為活性成分制備的抗菌藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、 膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方 法制備。
[0018] 本發明的還一個目的是提供所述化合物的制備方法。
[0019] 所述化合物的制備方法，是以肉座菌（Hypocreasp.)為轉化菌株，對丹參酮 IIA進行微生物轉化，使所述丹參酮IIA與所述肉座菌（Hypocreasp.)的自身代謝產物 sorbicillinol發生狄爾斯一阿爾德反應，所得產物即為所述化合物。
[0020] 所述肉座菌（Hypocreasp.)為木霉（Trichoderma)的有性型，sorbicillinol也 是木霉中常見的次級代謝產物。通過實驗本發明初步證明，該菌可以產生發生狄爾斯一阿 爾德反應的酶和底物sorbicillinol。
[0021] 在本發明中所述肉座菌（Hypocreasp.)具體為肉座菌（Hypocreasp. )FS4_3 CGMCC3. 17108。
[0022] 具體而言，所述制備方法包括如下步驟：將所述肉座菌（Hypocreasp.) FS4-3CGMCC3. 17108接種于發酵培養基中，25-30°C(如28°C)下培養3-4天（如3天）， 然后加入所述丹參酮IIA，在25-30°C(如28°C)下培養5-7天（如5天），得到發酵液；從 所述發酵液中獲得所述化合物。
[0023] 其中，所述培養為搖床旋轉培養，轉速為220rpm。
[0024] 所述發酵培養基組成如下：每升所述發酵培養基中含有200g馬鈴薯（去皮，切成 小塊煮沸20min，紗布過濾）、20g葡萄糖，余量為水；自然pH。
[0025] 在所述方法中，從所述發酵液中獲得所述化合物是通過如下實現的：將所述發酵 液過濾（如采用4層紗布過濾）后收集濾液，將所述濾液用有機溶劑萃取（如萃取3次） 后濃縮得到濃縮物（如用旋轉蒸發儀濃縮蒸干獲得所述濃縮物），將所述濃縮物依次通過 硅膠柱層析、反相高效液相色譜進行分離，得到所述化合物。
[0026] 在本發明中，進行所述萃取時，所述有機溶劑的用量為與所述濾液等體積。所述有 機溶劑為乙酸乙酯。
[0027] 在本發明中，進行所述硅膠柱層析時，以由體積比分別為100:1、100 :2、100:5、 100:10、100:20、100:50和100:100的環己烷和丙酮混合而成的7種洗脫液依次進行洗脫， 各洗脫液均洗脫5個柱體積；收集由體積比為100:5的環己烷和丙酮混合而成的洗脫液對 應的洗脫組分，濃縮（如采用旋轉蒸發儀進行濃縮）后得到濃縮液；進行所述反相高效液相 色譜時，將所述濃縮液按照如下條件進行反相高效液相色譜：色譜柱為C3反相色譜柱，檢測 波長為254nm，流動相為體積百分含量為65%的乙腈水溶液，等度洗脫，收集在254nm波長 處出現的保留時間為31.Omin的洗脫峰，獲得所述化合物；所述等度洗脫的流速具體可為 2mL/min〇
[0028] 另外，在本發明中，進行所述硅膠柱層析時，采用的硅膠粒度具體為200-300目； 硅膠柱具體為常壓柱（常壓柱），規格為50X400mm(玻璃柱）；柱溫為室溫（20-25°C);所 用硅膠量為15g;所述濃縮物的上樣量為1. 35mg。
[0029] 本發明采用肉座菌（Hypocreasp.)FS4_3CGMCC3. 17108為轉化菌株，以丹參 酮IIA為底物，通過微生物轉化方法制備狄爾斯一阿爾德反應產物，分離得到了化合物 Tanshisorbicin，經紫外光譜、質譜、核磁共振譜、⑶譜，檢測其結構正確。實驗證明本發 明提供的化合物結構全新，具有很好的抗菌活性，適宜于抗菌活性先導化合物的研究或制 備抗菌藥物。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發明所述化合物Tanshisorbicin的紫外圖譜。
[0031] 圖2為本發明所述化合物Tanshisorbic