Sh2結構域變體的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用 本申請要求2012年3月27日提交的美國臨時申請號61/616, 167的權益，其內容在此 全文被引入本發明作為參考。
技術領域
[0002] 本發明整體設及蛋白酪氨酸激酶信號，具體的，本發明設及對含有憐酸酪氨酸的 膚或蛋白具有增強的結合親和性的多膚，設及使用該多膚用于治療蛋白酪氨酸激酶相關的 失調的方法，例如免疫學的和腫瘤學的失調，設及使用該多膚用于診斷蛋白酪氨酸激酶相 關的失調的方法，設及使用該多膚用于檢測、追蹤或監控細胞中的酪氨酸憐酸化事件的方 法，設及使用該多膚用于富集或純化含有憐酸酪氨酸的膚或蛋白的方法，W及設及含有該 多膚的藥物組合物。
【背景技術】
[0003] 蛋白酪氨酸激酶（PTKs)及其底物在多種細胞進程中起重要作用，例如增殖、分 化、運動和調亡。憐酸酪氨酸（還稱為pTyr或pY)信號網中的異常激酶激活和伴隨的改變 是多種癌癥的標志。細胞用來翻譯pTyr介導的信號的主要機制依賴于特異性結合酪氨酸 憐酸化蛋白的模塊化蛋白結構域。Src同源區2(S肥）結構域是運些模塊化結構域中最普遍 的，并在PTK信號途徑中起核屯、作用。不同的pTyr位點使用不同的含甜2結構域的蛋白， 后者反過來激活不同的信號途徑。
[0004]PTKs尤其包括受體酪氨酸激酶，包括表皮生長因子激酶家族成員。在多種惡性和 非惡性增殖性疾病中已有顯示增強的PTKs活性。此外，PTKs在調節免疫系統細胞中起作 用是已知的。
[0005]PTKs是用于癌癥治療的重要藥物祀點。目前的抗癌藥主要基于小分子激酶抑制劑 或人源化抗體。運些藥物經常顯示對一組相關激酶的廣譜特異性，患者在接受治療1年左 右后最終對藥物發展出耐受性。
[0006] 抑制PTK信號的替代想法是通過遮蓋PTK底物的憐酸酪氨酸來阻斷下游信號。雖 然憐酸酪氨酸特異性抗體對含pTyr多膚具有高親和性，但是它們不能在細胞內使用。
[0007]pTyr特異性抗體（美國專利6,824,989)被廣泛用來檢測生物樣本中含有的 pTyr。然而，抗體不能在活細胞內使用。IgG抗體分子是總分子量為~150kDa的異四聚化 蛋白，其通過免疫系統中的B細胞分泌至胞外空間。抗體含有二硫鍵，在免疫系統中的細胞 外部起作用，且沒有被設計為在細胞質中起作用或透過細胞膜。因此，pTyr特異性抗體無 法被用作體內試劑用于在活細胞內部干擾設及蛋白酪氨酸憐酸化的胞內信號事件。
[0008] 含甜2結構域的蛋白在PTK信號下游起作用，且為信號集合點。甜2結構域含有~ 100個氨基酸且約比抗體分子小15倍。當分離的甜2結構域在細胞中遞送或表達時，其能 夠與結合pTyr位點的內生性信號蛋白競爭。然而，天然的甜2結構域被設計為介導與其同 源結合位點的瞬間相互作用，W確保動態細胞信號。換而言之，天然甜2結構域被內在地設 計為在體內不阻斷PTK信號途徑。由于該特征，天然SH2結構域無法用作強抑制試劑。
[0009] 美國專利號5, 786, 454("US454 ")公開了具有改變的結合位點的S肥結構 域，所述改變的結合位點改變了序列識別特異性。還有報道稱對甜2結構域目標結合位 點的修飾，包括缺失、取代或引入非天然氨基酸，能夠改變SH2結構域的序列識別特異性 ((Songyang等人，（1995)J.Biol.Qiem.,Vol. 270,卵.26029 ;Kimbe;r等人，（2000)Mol. Cell,Vol. 5,pp. 1043;Kaneko等人，（2010)Sci.Si即al. ,Vol. 3,卵.ra34;Virdee等人， (2010)Chemistry&Biology,Vol. 17,pp. 274)。通過該方法創造的甜2變體在一些情況下表 現出對其同源目標多膚的增強的特異性。然而，運些甜2變體通常W與對應的天然甜2結 構域相似的親和性結合至其同源目標多膚。
【發明內容】
[0010] 本發明設及與親代甜2結構域（包括野生型甜2結構域）相比，針對含憐酸酪氨 酸（"pTyr")的膚或蛋白具有增強的結合親和性的變體甜2結構域，設及使用該變體S肥 結構域治療蛋白酪氨酸激酶相關的失調（例如免疫學的和腫瘤學的失調）的方法，設及使 用該變體甜2結構域診斷蛋白酪氨酸激酶相關的失調的方法，設及使用該變體甜2結構域 追蹤細胞中的酪氨酸憐酸化事件的方法，設及該變體SH2結構域在研究中作為親和試劑或 檢測試劑的用途，W及設及包含該變體甜2結構域的藥物組合物。
[0011] 本發明還設及增強甜2結構域與含pTyr膚的結合親和性的一般策略。殘基取代 已被引入甜2結構域的pTyr-結合區域，并且闡述了對含pTyr膚的結合親和性增強的有利 取代。不同的取代組合表現了對親和性增強的不同程度的影響，并且所產生的變體甜2結 構域組（panel)顯示了親和性梯度。運些親和性增強的變體在體外結合分析中和在哺乳動 物細胞系中表現出比野生型對照甜2結構域更緊密的與含pTyr的蛋白的結合。因此，變體 結構域在生理環境中和在體外條件下都起作用。
[0012] 在一個實施方式中，本發明提供了一種結合含憐酸酪氨酸（pTyr)膚的變體SH2結 構域。在一個實施方式中，變體甜2結構域包括在親代甜2結構域的15個氨基酸位點的預 定義區域中具有至少一個氨基酸取代的親代甜2結構域，該取代增強了變體甜2結構域相 對于親代SH2結構域而言對含pTyr膚的親和性。
[0013] 在本發明的變體甜2結構域的一個實施方式中，當所述親代甜2結構域與SEQ IDNO: 1對齊時，親代S肥結構域的15個氨基酸的預定義的區域對應于SEQIDNO: 1的 Argl8 (位點 1)、Lysl9 (位點 2)、Ala21 (位點 3)、Arg38 (位點 4)、Ser40 (位點 5)、Glu41 (位 點 6)、T虹42 (位點 7)J虹43 (位點 8)、Ala46 (位點 9)、Ser48 (位點 10)、Leu49 (位點 11)、 Se巧0 (位點 12)、Lys63 (位點 13)、His64 (位點 14)、和Lys66 (位點 15)。
[0014] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，該至少一個取代包括在親代 SH2結構域中對應于位點10的位點處取代為小殘基或疏水殘基。
[0015] 在本發明的變體SH2結構域的另一個實施方式中，該小殘基或疏水殘基包括丙氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸或鄉氨酸。
[0016] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，該至少一個取代包括在親代 SH2結構域中對應于位點15的位點處取代為疏水殘基。
[0017] 在本發明的變體SH2結構域的另一個實施方式中，該疏水殘基包括異亮氨酸、亮 氨酸或鄉氨酸。
[0018] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，該至少一個取代包括在親代 SH2結構域中對應于位點10和15的位點處的取代。
[0019] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，該至少一個取代包括在親代 SH2結構域中對應于位點8和15的位點處的取代。
[0020] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，該至少一個取代包括在親代 SH2結構域中對應于位點8、10和15的位點處的取代。
[0021] 在本發明的變體SH2結構域的另一個實施方式中，該對應于位點8的取代包括取 代為苯丙氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、或鄉氨酸。
[0022] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，變體甜2結構域包括位點4的 精氨酸殘基、位點11的亮氨酸殘基和位點12的絲氨酸殘基。
[0023] 在本發明的變體SH2結構域的另一個實施方式中，變體S肥結構域包括選自SEQ IDNOs: 5-17、19-22的氨基酸序列。
[0024] 在本發明的變體甜2結構域的另一個實施方式中，親代甜2結構域是真核的 (eukaryotic)。
[0025] 本發明，在一個實施方式中，還提供了編碼根據上述任一實施方式的變體甜2結 構域的分離的DNA序列。
[0026] 本發明，在一個實施方式中，還提供了含有前述實施方式的DNA序列的載體。
[0027] 在一個實施方式中，本發明提供了本發明的變體SH2結構域在治療含pTyr膚相關 的失調中的用途。
[0028] 在另一個實施方式中，本發明提供了本發明的變體SH2結構域在抑制或預防細胞 中酪氨酸激酶的效果中的用途。
[0029] 在另一個實施方式中，本發明提供了一種用于預防或抑制細胞中酪氨酸激酶的效 果的方法，其特征在于該方法包括將上述實施方式的變體甜2結構域遞送或引入細胞中。
[0030] 在本發明的一個方面，在允許跨細胞運輸的載體中提供變體SH2結構域。
[0031] 在本發明的另一個方面，變體甜2結構域作為融合至細胞膜穿透分子的產物而被 提供。
[0032] 在另一個實施方式中，本發明還提供了上述實施方式的變體甜2結構域在評估樣 品中是否存在含pTyr膚中的用途。
[0033] 在一個實施方式中，本發明提供了評估樣品中是否存在含pTyr膚的方法，該方法 包括（a)用所述樣品接觸本發明的變體甜2結構域，從而如果樣品中存在含pTyr膚，會形 成含pTyr膚/變體SH2結構域復合物；和化）檢測復合物的形成，從而檢測樣品中是否存 在含pTyr膚。
[0034] 在另一個實施方式中，本發明還提供了本發明的變體甜2結構域在含pTyr膚信號 途徑的研究中和/或在分離含pTyr膚中的用途。
[0035] 在一個實施方式中，本發明設及一種用于從樣品中分離含pTyr膚的方法，其特征 在于該方法包括：(a)用所述樣品接觸本發明的變體SH2結構域，從而如果樣品中存在含 pTyr膚，會形成含pTyr膚/變體SH2結構域復合物；和化）從復合物中釋放該含pTyr膚， 從而從樣品中分離含pTyr膚。
[0036] 在前述方法的一個方面，該方法進一步包括通過檢測所釋放的含pTyr膚的量來 測定含pTyr膚在樣品中的濃度。
[0037]在另一個實施方式中，本發明提供了一種測定含pTyr膚在樣品中的濃度的方法， 該方法包括：(a)將本發明的變體甜2結構域固定在樹脂上，化）將樣品流經具有結合的變 體甜2結構域的樹脂，（C)通過添加去除變體甜2結構域結合含pTyr膚的能力的溶劑，釋 放結合到樹脂上的任何含pTyr膚，從而產生洗脫組份，和（d)測定在洗脫組份中存在的含 pTyr膚的濃度。
[0038] 在本發明的各方面，含pTyr膚的濃度通過高效液相色譜0PLC)進行確定。
[0039] 在本發明的各方面，變體甜2結構域被結合至親和性柱或側流試紙條。
[0040] 在另一個實施方式中，本發明提供了本發明的變體SH2結構域在體外或體內的膚 或蛋白中結合或檢測pTyr殘基的用途。
[0041] 在另一個實施方式中，本發明提供了一種制造相對于親代SH2結構域而言具有增 強的含pTyr膚結合親和性的變體甜2結構域的方法，其特征在于該方法包括取代親代S肥 結構域的15個氨基酸位點的預定義區域中至少一個氨基酸殘基，當所述親代甜2結構域與 SEQIDNO: 1對齊時，親代S肥結構域的15個氨基酸的預定義區域對應于SEQIDNO: 1的 Argl8 (位點 1)、Lysl9 (位點 2)、Ala21 (位點 3)、Arg38 (位點 4)、Ser40 (位點 5)、Glu41 (位 點 6)、T虹42 (位點 7)J虹43 (位點 8)、Ala46 (位點 9)、Ser48 (位點 10)、Leu49 (位點 11)、 Se巧0 (位點 12)、Lys63 (位點 13)、His64 (位點 14)、和Lys66 (位點 15)。
[0042] 在一個實施方式中，本發明提供了包含多個甜2結構域的多膚，該多膚中至少一 個所述多個甜2結構域為本發明的變體甜2結構域。
[0043] 通過參考下述附圖，本發明的運些方面和其它方面根據發明詳述將變得顯而易 見。
【附圖說明】
[0044] 根據本文給出的發明詳述和伴隨的附圖，將更全面地理解本發明，運些發明詳述 和附圖僅W說明的方式給出，而不限制預期的發明范圍。
[0045] 圖1 (A)顯示了圍繞著pTyr的15個殘基位點的位置和用于定義運些位點的序列 比對。
[0046] 圖1做顯示了pTyr在人巧nS肥結構域上的結合位點。原子坐標源自蛋白質數 據庫ID: 1A0T(Mu化ern等，（1997)StrucUire,Vol. 5,PP. 1313)，其描述了巧nS肥結構域和 結合的含pTyr膚的結構。在此圖中，為清楚起見，只有結合膚中的pTyr殘基W插入的方式 進行了顯示。圍繞著結合pTyr的15個甜2結構域殘基W深灰色陰影顯示。甜2結構域的 骨架結構顯示為條帶狀。15個殘基的位置展示為球狀。
[0047] 圖2(a)顯示了圍繞著pTyr的15個殘基位點的位置和用于定義運些位點的序列 比對。根據一個實施方式，該15個位點被定義在巧nS肥結構域上（圖2a上陰影黑色殘 基）。序列比對（圖2a)包含人巧nSH2結構域（始于殘基W149)、人SrcSH2結構域（始 于殘基W151)和人Grb2S肥結構域（始于殘基W60)。S肥結構域上的15個位點可從包括 人巧nSH2結構域的序列對齊中定義（圖2a)。圖2(b)說明了在對齊中存在對齊缺口時確 定15個位點的一個實施方式。根據圖2(b)中所示的實施方式，位點4處的精氨酸首先定 義，然后位于位點4殘基C端的位點5、6、7和8處的殘基將分別被定義為第2、3、4和5個 殘基。圖2(c)顯示了根據本發明對15個位點的編號和由Eck等定義的對應的編號系統的 對比（1993,化 1:ure，Vol. 362,PP. 87)。
[0048]圖3列舉了用于本發明的隧菌體展示篩選實驗的含pTyr的合成膚。運些膚在其 N端生物素化，在其C端酷胺化。
[0049] 圖4是顯示根據本發明的一個實施方式獲得的人巧nS肥結構域的63個變體的 15個位點的殘基的表格。從野生型取代的殘基為陰影黑色。
[0050] 圖5是顯示圖4的63個變體中觀察到的取代殘基的列表。
[0051] 圖6列舉了用于本發明巧光偏振分析的含pTyr的合成膚。運些膚在其N端巧光 素標記，在其C端酷胺化。
[0052] 圖7顯示了測定FynS肥結構域和圖5中列舉的膚之間相互作用親和性的溶液內 巧光偏振結合分析結果。圖7 (a)顯示了膚和含有如第一行所示取代的變體巧nS肥結構 域之間相互作用的解離常數化d)值（WyM為單位）。針對每個膚-變體組合計算了相對 于野生型的親和性增強，如圖7(b)所示。變體從左至右按照平均親和性增強進行分類。
[0053] 圖8顯示了通過巧光偏振（AF巧的增加測定的野生型或變體巧nS肥結構域與膚 的結合曲線和1((1值。圖8(曰）顯示了野生型巧118肥結構域與巧光素-66口￥66膚669 10 NO:23)的結合。圖8化）顯示了T8V/S10A/K1化變體巧nS肥結構域與巧光素-GGpYGG膚 (SEQIDN0:23)的結合。圖8(c)顯示了在T8V/S10A/K1化變體SH2結構域和非憐酸化的 巧光素-GGYGG膚（SEQIDN0:24)之間觀察到的不明顯信號。
[0054] 圖9是說明測定SrcS肥結構域和圖5中列舉的膚之間相互作用親和性的溶液內 巧光偏振結合分析結果的表格。圖9 (a)是顯示含pTyr膚和野生型或變體SrcSH2結構域 之間相互作用的Kd值（WyM為單位）的表格。針對每個膚-變體組合計算了相對于野 生型的親和性增強，如圖9(b)所示。
[00巧]圖10(a)是顯示野生型SrcS肥結構域與巧光素-GGpYGG膚（SEQIDNO:23)的結 合曲線和Kd值的圖。圖10化）是顯示T8V/C10A/K1化變體SrcS肥結構域與巧光素-GGpYGG 膚（SEQIDN0:23)的結合曲線和Kd值的圖。
[0056] 圖11顯示了 8V/10A/1化取代的巧n、Grb2和SrcS肥結構域（稱為TrM)與野 生型（稱為Wt)結構域相比在EGFR下游細胞信號中的效果。甜2結構域與GFP融合并在 肥K293細胞中表達。圖11 (a)是顯示TrMS肥結構域比化結構域更緊密結合EGFR的蛋白 質印跡圖。IP:免疫沉淀，IB:免疫印跡。圖11(b)顯示了在表達TrMS肥結構域的細胞中 Erk憐酸化被顯著降低。Erk位于EGFR信號途徑的下游。圖11(c)是顯示圖11(b)中相對 于設定為100 %的GFP空載體對照的祀rk條帶強度定量的圖。
[0057] 圖12顯示了TrM(8V/10A/15k取代的）S肥結構域對肥K293細胞生長的抑制效 果。S肥結構域在肥K293細胞中作為GFP融合蛋白表達。圖12(曰）是顯示相對于6。口空載 體對照對細胞活性的抑制效果的圖。圖12(b)是顯示通過軟瓊脂分析觀察到的8V/10A/1化 取代的SH2結構域對菌落形成的抑制效果的圖，其相對于GFP空載體對照定量。圖12(c) 是圖12(b)中定量菌落的示例照片。在圖12(a)和12(b)中，黑條表示TrM，白條表示化。 相對于GFP空載體對照樣品（設定為100% )計算數量。
[0058] 圖13是顯示TAT-S肥蛋白在細胞中轉導的照片。對細菌表達的、純化的 TAT-FynS肥結構域用FITC進行標記并與肥K293細胞一起在指示的濃度（列）和時間（行） 下培育。1虹培育后在2.5iiMS肥蛋白下觀察到有效的蛋白輸入（trans化Sion)。
[005引圖14顯示了如谷脫甘膚S-轉移酶（GST)沉淀（pulldown)分析所示的，與化甜2 結構域相比巧nTrMSH2結構域的增強的結合酪氨酸-憐酸化蛋白的能力。I