鑒別布魯氏菌a19疫苗株與野毒株的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 布魯氏菌病（Brucellosis)是由布魯氏菌屬細菌引起的一種廣泛分布于世界各 地的人畜（獸）共患傳染病，其不僅影響畜牧業的健康發展而且危害人類公共衛生健康。 根據國家衛計委公布的全國法定傳染病疫情數據，2014年我國人感染布魯氏菌病人數為 57222,發病率比2013年增長了 31. 48%。人感染布魯氏菌病的傳染源主要來源于感染的動 物及被污染的畜產品，因此，控制和消滅動物布魯氏菌病，是防止人類感染布魯氏病的根本 保障。
[0003] 目前疫苗免疫仍是控制動物布魯氏菌病的主要措施之一。當前國外主要使用的布 魯氏菌疫苗株是牛種S19株和RB51株以及羊種Rev. 1株，這些疫苗株我國目前尚未引進和 使用。我國使用的疫苗株主要是牛種布魯氏菌A19疫苗株和豬種布魯氏菌S2疫苗株，以前 還曾使用過羊種M5-90疫苗株，由于毒力問題現在暫時不再使用。A19疫苗株的使用為我國 動物群布魯氏菌病的防控提供了重要保障，該菌株是光滑型，其LPS含有0-側鏈，能持續刺 激機體產生抗體，對牛有一定的保護力，但是也存在著無法鑒別A19疫苗株與野毒感染株 的關鍵技術瓶頸問題。雖然競爭ELISA(cELISA)和熒光偏振實驗（FPT)以其高通量以及操 作方面的優勢，在布魯氏菌弱毒疫苗與野生菌株感染的血清學鑒別有一定的應用，但是對 未知背景的血清樣本來說，單次檢測仍不能確切分辨疫苗免疫或野毒感染。從病原學方面 鑒別診斷布魯氏菌野毒株核酸，可以準確判斷動物體是否帶菌，為布魯氏菌病陽性動物的 檢疫淘汰提供技術支撐。因此，利用分子生物學方法，依據A19疫苗株與其他布魯氏菌毒株 基因組差異堿基序列，通過PCR擴增及PCR產物序列測定，可有效實現A19疫苗株與野毒株 的分子鑒別，將其應用于臨床鑒別，可以為我國A19疫苗株的鑒別提供技術保障。
【發明內容】
[0004] 發明人通過基因組序列比對，發現與其他布魯氏菌屬細菌基因組DNA序列不同的 是，A19疫苗株在基因組22840位點處，即SEQ ID No. 3的344位點處，缺失7個核苷酸序 列，該位點后序列為AGATTTCAGA，其他布魯氏菌序列為AGATTTCAGATTTCAGA，因為此處為 AGATTTC的重復序列，所以在序列比對時會出現兩種序列缺失現象（AGATTTC或TTTCAGA)。 在該缺失位點上下游處設計引物，通過PCR擴增后序列測定，序列比對以及測序峰圖的不 同就可以特異性鑒別牛種布魯氏菌A19疫苗株，以上是提出本發明的技術依據。
[0005] 本發明的目的是提供一種鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的試劑盒及其使用 方法，該試劑盒能夠特異地鑒別臨床樣本中布魯氏菌A19疫苗株。
[0006] 為實現本發明目的，采用如下技術方案：
[0007] 鑒別布魯氏菌疫苗株A19與野毒株的試劑盒，該PCR試劑盒由PCR反應液、DNA聚 合酶、陽性質控標準品和陰性質控標準品組成；
[0008] 所述PCR反應液包括鑒定并測序A19疫苗株特異性核苷酸序列的引物對，其中鑒 別A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示，分 別如下：
[0009] SEQ ID No. 1 :5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0010] SEQ ID No. 2 :5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0011] 所述陽性質控標準品為牛種布魯氏菌A19疫苗株陽性質控標準品；
[0012] 所述牛種布魯氏菌A19疫苗株陽性質控標準品由含有562個堿基的核苷酸片段構 成的PEASY-T3重組質粒組成。
[0013] 所述含有562個堿基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo. 3所示：
[0014] SEQIDNo. 3 ：
[0015] 5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCACCCTTTACCGTCGCATCATTGCAGACGATCATGCATTCG CGGCCCGATACGCGCCCGATGCCGGTGATGAAGCCAGCGGCGGGCGCTGCCCCGCCATACATGCCATGCGCTGCCGT CAGCCCCAGTTCCAGAAAGGGGGAACCCGGATCGAGCAATTGCGCCACGCGCTCACGGGGCAGAAGTTTTCCGCGCG AAACATGGCGGTCGCGCGCTTTCTCGCCGCCGCCGTCAATGGCAATGCGCGAGGCTTCCGCCACCACGTCGATTGCC GCCAGCATGGCCTTGCGGTTGGCCTCGAAGCTTGCGCTGCGCGTCGAGATTTCAGAACCGGCATCAACGGGTCTCCT GAAAGAGTTCCCGTCCGATCAGCATACGCCGGATTTCCGACGTGCCCGCGCCGATTTCATAAAGCTTGGCATCGCGC AAAAGGCGGCCCGTCGGATAATCGTTGATATAGCCGTTGCCGCCGAGAGACTGGATCGCCTGCAAGGCCATCTGCGT GGCATTTTCCGCAGAGTAAAGAATGCAGCCCGCC-3'
[0016] 所述PCR反應液還包括含有dNTPs、Mg'雙蒸水的PCR緩沖液。
[0017] 所述含有562個堿基的核苷酸片段是從牛種布魯氏菌A19疫苗株中克隆得到。
[0018] 所述陰性質控標準品為無菌雙蒸水（(IdH2O)。
[0019] 本發明進一步提供了鑒別布魯氏菌A19疫苗株與野毒株的PCR試劑盒的使用方 法，該方法的條件和步驟如下：
[0020] (1)提取待測樣本的基因組DNA ;
[0021 ] 所述待檢測的樣本為血液、奶樣、組織樣本、氣溶膠樣本等。
[0022] (2)以提取的樣本基因組DNA為模板，將樣本DNA、陽性質控標準品和陰性質控標 準品分別加入到含有PCR反應液和DNA聚合酶的50 μ L體系的PCR反應管中，按照經過優 化后的PCR反應條件進行擴增，具體的反應條件為：94°C 3min，94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C 30sec，35 個循環，72°C IOmin;
[0023] 所述PCR反應液由鑒定布魯氏菌A19疫苗株的引物對以及含有dNTPs、Mg'雙蒸 水的PCR緩沖液組成；
[0024] 所述引物對分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,分別命名為A19-F和A19-R序列 如下：
[0025] 正向引物 A19-F :5' -TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0026] 反向引物 A19-R :5' -GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0027] 所述的PCR反應體系為50 μ L，具體包括以下組份：
[0028]
[0029] (3)取50yL PCR產物，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察鑒別牛種布魯氏 菌A19株引物對擴增出562bp及與之大小對應的條帶；本領域技術人員應知曉，在瓊脂糖凝 膠電泳檢測時，顯示與目的條帶大小對應的條帶，意指PCR擴增產物大小相近，因樣品來源 或目標種屬不同，PCR產物大小會有較小差異，但顯示條帶對應，例如相差30bp/20bp范圍 內的條帶均顯示大小對應。
[0030] (4)如果上述PCR檢測結果與目的條帶不符，則說明模板為布魯氏菌陰性，如果 PCR檢測條帶大小正確，則對陽性條帶進行切膠回收純化，然后再進行序列測定。
[0031] (5)鑒別布魯氏菌A19疫苗株的結果判定：使用A19-F引物對純化的562bp或與 之大小對應的產物進行測序，如果測序結果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后完全匹配， 則該樣本為A19疫苗株；如果測序結果峰圖為單一峰，與SEQIDNo. 3比對后在第344位點處 多出7個核苷酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，則該樣本為除A19疫苗株以外的其他布魯氏菌 野毒株或疫苗株；如果測序結果與SEQIDNo. 3比對，在峰圖的序列第354位，即AGATTTCAGA 后出現套峰，則該樣本為A19疫苗株和其他布魯氏菌株混合。
[0032] 本領域技術人員應當明了，上述鑒別方法，其直接目的是鑒別菌株種類，而非獲取 疾病診斷結果。
[0033] 本發明取得了以下效果：
[0034] (1)為我國A19疫苗株的鑒別提供新的技術手段；
[0035] (2)本發明所述引物對具有較高的特異性，通過擴增-電泳檢測，可有效的區分布 魯氏菌和其他常規細菌菌株；
[0036] (3)本發明所述鑒別方法，有效地將布魯氏菌A19疫苗株與其他布魯氏菌野毒株 或疫苗株區分開來，具有極高的準確率。
【附圖說明】
[0037] 圖I A19疫苗株缺失位點處上下游序列PCR擴增，+ :模板為A19疫苗株陽性質控 標準品的PCR擴增產物562bp，-:模板為陰性質控標準品，1-5:模板分別為牛種布魯氏菌 疫苗株A19株、豬種布魯氏菌疫苗株S2株、羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株、綿羊種布魯氏菌 63/290株、犬布魯氏菌RM6/66株基因組DNA的PCR擴增產物562bp ;6-10 :模板分別為大 腸桿菌0157:H7、小腸結腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、牛分支桿菌基因組 DNA0
[0038] 圖2 A19疫苗株缺失位點處序列測定峰圖，A :測序峰圖為單一峰，與SEQ ID No. 3 比對后完全匹配，檢測模板為A19疫苗株。B :測序峰圖為單一峰，與SEQ ID No. 3比對后在 344位點處多出7個核苷酸序列（AGATTTC或TTTCAGA)，檢測模板為除A19疫苗株以外的其 他布魯氏菌野毒株或疫苗株。C :測序結果與SEQ ID No. 3比對，峰圖在序列第354位點后， 即AGATTTCAGA序列后出現套峰，檢測模板為A19疫苗株與其他布魯氏菌株的混合。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例用于進一步說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0040] 以下實施例均按照常規試驗條件與方法進行，或者按照制造廠商所建議的試驗條 件。
[0041] 1.試驗材料
[0042] 牛種布魯氏菌疫苗株A19株（B. abortus A19)，豬種布魯氏菌疫苗株S2株（B. suis S2)，羊種布魯氏菌疫苗株M5-90株（B. melitensis M5-90)，綿羊種布魯氏菌63/290株 (B. ovis 63/290)，犬布魯氏菌 RM6/66 株（B. canis RM6/66)，大腸桿菌 0157:H7、小腸結 腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌（CMCC256