一種生物活性透明質酸片段、其生產方法、應用、制劑及含有該制劑的物品的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化妝品、護膚品、衛生用品、生物醫藥領域，具體地，涉及一種生物活性 透明質酸片段、其生產方法、應用、制劑及含有該制劑的物品。
【背景技術】
[0002] 透明質酸，又稱玻璃酸、糖酸酸、玻尿酸，英文名hyaluronic acid(簡稱HA),是 由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級多糖，雙糖單位可達25000道爾。人體皮下 組織、表皮、角質層、皮脂腺、毛囊和粘膜含有大量的透明質酸，皮膚成熟和老化過程也隨 著透明質酸的含量和新陳代謝而變化，隨著年齡的增長及機體的老化，18歲時透明質酸就 開始流失，25歲以后開始加速流失，30歲的肌膚，透明質酸的含量只有嬰兒時期的65%， 到了 60歲只有25%。透明質酸是自然界中發現的保濕性能最好的物質，皮膚中的水分也會 跟著透明質酸的流逝而散失，人體皮膚表層（角質層）水分含量約占20-35%，顆粒層含水 量50-60%，低于或高于此值均不適，具有燥感或膩感，長期如此，會使皮膚干裂或水腫， 從而使皮膚失去彈性，粗糙老化。目前，透明質酸的生產廠家很多，主要使用微生物發酵 方法，多選用鏈球菌或乳酸球菌做菌種，以葡萄糖作為碳源發酵液，發酵結束后，過濾除 去菌絲體和雜質，然后乙醇沉淀得到高純度的透明質酸產物。
[0003] 大分子透明質酸在皮膚粘膜表面形成一個透氣的膜，主要是保護和濕化皮膚，基 本沒有其他生物活性，如何利用大分子透明質酸，開發其多種用途，實屬當前重要研發課題 之一。
【發明內容】
[0004] 我們最近的研究表明，人體主要細胞外基質大分子透明質酸參與人體非特異性免 疫功能的調節是通過炎癥區產生的有透明質酸酶活性的物質切割大分子透明質酸后產生 的低分子透明質酸來實現，即有生物活性的透明質酸是被能識別透明質酸正常結構的透明 質酸酶切割的末端和適當分子量的低分子量的透明質酸，這種生物活性透明質酸和受體結 合能力增加，從而促進皮膚粘膜組織分泌殺菌抗病毒的防衛素2和抑制炎癥。
[0005] 本發明的目的在于提供一種透明質酸片段的生產方法，可使不具有生物活性的大 分子透明質酸變為安全的且具有較高生物活性的透明質酸片段。
[0006] 本發明的第二個目的在于提供一種安全的具有生物活性的透明質酸片段。
[0007] 本發明的第三個目的在于提供一種具有生物活性的透明質酸片段的應用。
[0008] 本發明的第四個目的在于提供一種安全的、具有生物活性的透明質酸類制劑。
[0009] 本發明的第五個目的在于提供一種含有生物活性透明質酸類制劑的物品。
[0010] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0011] -種生物活性透明質酸片段的生產方法，以大分子透明質酸為原料，使用CHO細 胞生產的有糖化的重組人透明質酸酶PH20進行切割，制成分子量為10KD-60KD透明質酸 片段，所述片段至少有一端是使用能識別透明質酸正常結構的重組人透明質酸酶切割的末 端。
[0012] 進一步地，在進行重組人透明質酸酶酶切割前，先對原料進行烘烤和/或溶解臭 氧處理來降低分子量。
[0013] 進一步地，所述大分子透明質酸是純度為90. 0%-99. 9%的分子量為1000-1800KD 的透明質酸原料，當進行烘烤和溶解臭氧處理時，兩者的順序是先110-120度烘烤后溶解 臭氧處理。
[0014] 進一步地，所述大分子透明質酸是純度為90. 0%-99. 9%的分子量為200-600KD的 透明質酸原料。
[0015] 進一步地，所述重組人透明質酸酶切割條件為：在pH5. 0-5. 5、37度和存在NaCl、 Mg離子和Ca離子的條件下切割。
[0016] 進一步地，所述CHO細胞生產的有糖化的重組人透明質酸酶PH20是使用富含GC 動物細胞表達載體pMH3、4或5在CHO-S細胞系穩定表達和生產的，所述重組人透明質酸酶 PH20的基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0017] -種生物活性透明質酸片段，采用上述的生產方法生產得到。
[0018] 上述生物活性透明質酸片段的應用，所述片段具有促進組織、細胞、皮膚、粘膜分 泌防衛素2和抑制皮膚粘膜組織炎癥的生物活性，并具有抑制皮膚過多油脂分泌的生物活 性，用于制備殺滅微生物、抑制皮膚粘膜組織炎癥疾病和/或抑制皮膚過多油脂分泌的制 劑，或用于制備含有殺滅微生物、抑制皮膚粘膜組織炎癥疾病和/或抑制皮膚過多油脂分 泌的制劑的物品。
[0019] -種生物活性透明質酸類制劑，含有上述分子量為10KD-60KD的透明質酸片段。
[0020] 進一步地，所述制劑包含1-4%質量百分濃度的分子量為10KD-60KD透明質酸片 段。
[0021] 進一步地，所述制劑還包含5-10mg/L金環蛇抗菌肽BF或者15-30mg/L人抗菌肽 LL-37。
[0022] 進一步地，還包括5000-10000單位/ml的干擾素。
[0023] 進一步地，所述制劑為滴眼液或眼部護理液或漱口口服液或注射點滴液。
[0024] 進一步地，還包括1-3%質量百分濃度的甘油。
[0025] 進一步地，所述制劑為皮膚噴劑、尿布性皮炎噴劑、液體創口貼或口腔牙齦鼻咽噴 劑。
[0026] 進一步地，還包括0. 15-0. 3%質量百分濃度的分子量為200KD-400KD透明質酸、 0. 05-1. 5%質量百分濃度的分子量為1800KD或以上的透明質酸。
[0027] 進一步地，所述制劑為面膜、尿布性皮炎膜、頭皮護理液或陰道護理液。
[0028] 進一步地，還包括1-3%質量百分濃度的甘油、0. 15-0. 3%質量百分濃度的分子量 為200KD-400KD透明質酸、0. 05-1. 5%質量百分濃度的分子量為1800KD或以上的透明質酸。
[0029] 進一步地，所述制劑為避孕套潤滑液，所述避孕套潤滑液用于保護子宮頸、陰道和 外陰皮膚炎癥性疾病或用于綜合精液中的透明質酸酶防止精子通過子宮頸粘液栓進入卵 子。
[0030] 進一步地，所述制劑為飲品添加劑，所述飲品添加劑含有1-2%質量百分濃度的分 子量為10KD-60KD透明質酸片段液體或噴干粉。
[0031] 進一步地，所述制劑為肺吸入劑，所述10KD-60KD透明質酸片段為干粉。
[0032] 進一步地，還包含金環蛇抗菌肽BF或者人抗菌肽LL-37 ;所述10KD-60KD透明質 酸片段干粉與金環蛇抗菌肽BF的重量比為0. 1-1. 0 :0. 01-0. 02 ;所述10KD-60KD透明質酸 片段干粉與人抗菌肽LL-37的重量比為0. 1-1. 0 :0. 03-0. 06。
[0033] 進一步地，每0· 1-1. Omg的10KD-60KD透明質酸片段干粉，還配合有5000-10000 單位的干擾素。
[0034] 進一步地，所述制劑為干粉口服劑，所述10KD-60KD透明質酸片段為干粉。
[0035] 進一步地，還包含氨基葡萄糖，所述10KD-60KD透明質酸片段干粉與氨基葡萄糖 的重量比為50-200 :50-1000。
[0036] -種含有生物活性透明質酸類制劑的物品，所述物品為紙尿褲，所述紙尿褲的內 表面包覆層內含有上述的生物活性透明質酸類制劑。
[0037] 由于采用上述技術方案，本發明至少具有以下優點：
[0038] 1、使用CHO細胞生產的有糖化的重組人透明質酸酶，沒有免疫原性，不引起過敏 反應，少量殘留在最終產品中沒有安全性問題。
[0039] 2、經實驗驗證了有生物活性的透明質酸是具有透明質酸酶切割的末端和適當分 子量的低分子量的透明質酸，具有能識別透明質酸正常結構的透明質酸酶切割的末端低分 子量透明質酸（10KD-60KD)可以和受體結合，促進皮膚粘膜組織分泌殺菌抗病毒的防衛素 2,有殺滅微生物和抗炎的生物活性，還具有抑制皮膚過多油脂分泌的生物活性。
[0040] 3、生產方法中采用的烘烤，其使用物理方法可減少大分子透明質酸原料溶解后的 分子量和粘度，并進一步去除大分子透明質酸原料中的殘留有機物和酸性物質；溶解臭氧 處理，其使用化學方法可進一步減少大分子透明質酸原料溶解后的分子量、粘度，并除色除 味。
[0041] 4、聯合上述生物活性透明質酸片段、金環蛇抗菌肽或者人抗菌肽
[0042] LL-37、甘油等制成復方制劑（噴劑、滴劑、護理劑、洗劑、貼劑、漱口 口服劑、飲品添 加劑、肺吸入劑、干粉口服劑、靜脈注射點滴液等)，可廣泛用于預防和治療皮膚粘膜組織炎 癥性疾病。
【具體實施方式】
[0043] 以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用 于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0044] 實施例1
[0045] 目的：重組人透明質酸酶PH20的基因構建、表達、免疫學檢測、活性檢測和反應器 生產。
[0046] 方法：申請人利用有自主知識產權的非基因拷貝擴增技術，即富含GC動物細胞 表達技術（W0/2008/091276)和動物細胞反應器（W02006/138143和W02007/142664)技術， 使用新型CHO細胞（CHO-S)生產出高質量可商業化的重組人透明質酸酶PH20。具體為：通 過PCR的方法將表達PH20氨基酸順序的結構基因 （SEQ ID No. 1)合成，并構建到富含GC 的動物細胞表達載體pMH3、4或5中，已在W0/2008/091276中公開。小量制備這幾種表達 質粒后，穩定轉染到無血清懸浮培養的新型CHO細胞（CHO-S)中。通過G418篩選，用槍頭 手動挑取穩定克隆到96孔板中。當細胞匯合度大于50%時，更換無血清新鮮培養基；3-6 小時后，收集培養基樣品，通過檢測透明質酸酶生物活性，選出表達量最高的克隆多個。在 40ml搖瓶懸浮流加培養13天，活性單位呈增長趨勢，最高收液培養液中活性單位為2000U/ ml。繼續在尖底小搖瓶內進行無血清培養和做傳代穩定性研究；選出傳代穩定的克隆在5L 激流式反應器內進行擴增。PH20在AP20SC (5L)反應器上的大規模培養工藝開發：接種密 度：2X 106 個 cells/ml ;參數工藝：T :生長期 37°C，表達期 34°C ;D0 :5-10% ;PH :6· 8-7. 2 ; 生長期培養基：B001，流加培養基：FOOl+糖；培養進入表達期后，每天調一次PH至6. 8,然 后關閉加堿泵；培養周期16天，最高活性為3522U/ml。
[0047] 結果：（1)重組人透明質酸酶PH20在新型CHO細胞（CHO-S)中成功表達，western blot結果表明篩選到重組人透明質酸酶PH20穩定高表達克隆所產生的條帶分子量大小正 確；（2)高表達克隆在尖底小搖瓶內進行無血清培養和做傳代穩定；（3)穩定的高表達克隆 在5L激流式反應器內進行流加培養擴增，各批次豐收液中透明質酸酶活性達到1800-3500 活性單位/毫升，達到了工業化生產水平。
[0048] 結論：使用富含GC的動物細胞表達載體pMH3、4或5,重組人透明質酸酶PH20在 新型CHO細胞（CHO-S)中成功表達，各批次豐收液中透明質酸酶活性達到1800-3500活性 單位/毫升，即每毫升培養液可以生產150單位的注射用重組人透明質酸酶5-10支，滿足 工業化生產要求。
[0049] 實施例2
[0050] 目的：重組人透明質酸酶PH20的分離純化。
[0051] 方法：發酵液前處理：將所得5L激流式反應器所得發酵液使用固液分離裝置(離 心機、膜包、中空纖維柱、套筒等)獲得上清，在IOmM Tris pH7. 5中切向流透析，然后通過Q 瓊脂糖離子交換層析、苯基瓊脂糖疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析和SP瓊脂糖離子交 換層析，純化人重組透明質酸酶。
[0052] 層析：用IOmM Tris+50mM NaCl pH7. 5緩沖液沖洗10個柱體積，將人重