一種玉米秸稈發酵制備l-蘋果酸以及米根霉菌突變株-2的選育方法
【專利說明】
的選育方法一、
技術領域
[0001]本發明涉及農作物秸桿的綜合利用，確切地說是玉米秸桿發酵制備L-蘋果酸以及發酵菌株米根霉菌突變株-2的選育方法。
二、【背景技術】
[0002]蘋果酸化學名稱為2-羥基-1.4- 丁二酸，由于連接羥基的碳原子為不對稱碳原子，導致在旋光性上表現為右旋(D-)、左旋(L-)和外消旋(DL-)。因為蘋果酸的手性結構，故常以三種形式存在，包括D-蘋果酸、L-蘋果酸、DL-蘋果酸。在果實中最常見的是L型，呈現白色結晶或粉末，有特殊的酸味。
[0003]L-蘋果酸是一種重要的有機酸，廣泛運用于食品和化學等領域。與檸檬酸相比，蘋果酸酸度大、產熱低，味道柔和、持久且具特殊香味，被譽為“最理想的食品酸味劑”。
[0004]傳統的L-蘋果酸發酵是以葡萄糖或者淀粉類為原料，若能利用農作物水解液發酵產L-蘋果酸，將擴大原料來源，有效降低成本。在我國生物質纖維素原料豐富，但利用率低，一般采取焚燒填埋等方式處理，不僅浪費資源也對生態環境造成了破壞。有關利用生物質纖維素生產生物乙醇、生物柴油等研究報道很多，但利用生物質纖維素生產有機酸尤其是L-蘋果酸的報道較少。如何利用玉米秸桿水解液發酵產L-蘋果酸具有深遠的意義。
[0005]自然界中產L-蘋果酸的菌有米根霉、黃曲霉、寄生曲霉、華根霉等，其中米根霉產L-蘋果酸具有營養要求簡單、好氧發酵、產物純度高等特點而被廣泛使用。對于微生物菌株進行誘變處理可在短時間內篩選出合適的菌株，積累對人類有益的某一種或幾種代謝產物，同時減少副產物的生成，最終將篩選得到的高產、優質菌種推廣應用，目前所運用的誘變方法主要包括紫外照射誘變，電離輻射誘變，離子注入誘變，航天育種，復合誘變等。
[0006]60Co屬于電離輻射誘變，因其具有高能量，可以通過電離作用直接或間接改變DNA結構，從而達到誘變目的。利用6°Co輻射結合丙烯醇平板篩選乙醇脫氫酶缺陷型菌株，阻斷了乙醇代謝，降低副產物乙醇生成。利用6°Co輻射結合氟乙酸平板篩選乙醛酸循環缺陷型菌株，降低了副產物富馬酸及琥珀酸的產量。
[0007]在目前的L-蘋果酸生產過程中，多以葡萄糖、淀粉等作為發酵碳源，原料成本高。發酵過程中伴隨乙醇、富馬酸、琥珀酸等副產物的生成，且采用分批發酵，發酵周期長，連續性弱。
三、
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于利用玉米秸桿制備L-蘋果酸，所要解決的技術問題利用生物發酵的方法以及選育一株產量高且副產物少的米根霉菌優良的突變菌株。
[0009]本發明利用玉米秸桿發酵制備L-蘋果酸的方法，包括液體培養基的配制、滅菌、接種、發酵培養和分離，與現有技術的區別是所述的液體培養基是以濃度為85-115g/L的玉米秸桿水解液作為培養基的基材，也作為碳源，同時添加氮源、無機鹽和中和劑，具體為在IL水解液中添加硫酸銨3.5?4.5g/L、硫酸鎂0.25?0.35g/L、硫酸亞鐵0.020?0.030g/L、磷酸二氫鉀0.45?0.55g/L、硫酸鋅0.05?0.15g/L、碳酸鈣70?90g/L ;培養基滅菌后接種米根霉菌突變株_2，孢子濃度為16?10 sCFU/mL、接種量為發酵液的8?12vt% (體積百分比，下同)，所述的發酵培養是在發酵罐中于31?33°C、通氣量(空氣)0.35?0.45L/L.min條件下攪拌發酵70?75小時，發酵后固液分離；發酵液米用堿性離子交換樹脂D301進行吸附分離，pH為3?4，溫度20?30°C，水洗脫，得L-蘋果酸水溶液，對其進行定性分析，結果如圖2所示。
[0010]優選液體培養基濃度:玉米秸桿水解液100g/L，硫酸銨0.40g/L，硫酸鎂0.30g/L，硫酸亞鐵0.025g/L，磷酸二氫鉀0.50g/L，硫酸鋅0.10g/L，碳酸鈣80g/L。
[0011]優選孢子濃度107CFU/mL，接種量1vt % (體積百分比)。
[0012]所述的玉米秸桿水解液是玉米秸桿粉碎過40目篩，加入I?2倍量(以質量計，下同)的水于球磨機中濕球磨I?2h ;然后轉入水解釜中，再加5?6倍量的水，并用硫酸溶液調pH值2?3，于110?130°C攪拌水解I?1.5小時，水解后用氨水調pH值4.5?5.5，固液分離；濾液濃縮至濃度85?115g/L，即是玉米秸桿水解液。
[0013]所述的米根霉菌突變菌株是這樣選育的:
[0014]1.利用同位素6°Co對出發菌株米根霉菌(Rhizopus oryzae CICC41160)進行誘變，誘變劑量10?30Gy，輻照時間為20min。
[0015]2.60Co誘變結合丙烯醇平板篩選得突變株-1，丙烯醇濃度在6ml/L時出發菌株出現顯著性抑制，故在丙烯醇濃度6ml/L時篩選出了突變株-1，用于后續誘變。
[0016]3.以上步誘變得到的突變株-1為親本菌株，通過6°Co(10?30Gy，20min)誘變結合氟乙酸平板篩選得突變株-2 (突變菌株)。選取氟乙酸濃度為7g/L，挑取在此濃度上生長的缺陷型突變株，該菌株即為突變株_2，作為本發明的發酵菌株，用作后續發酵。(具體機制見圖3突變菌株選育的內部機制圖)。
[0017]4.取步驟3所得發酵突變菌株孢子懸液單獨培養48h用于發酵，孢子濃度16?
10sCFU/mLo
[0018]相比與現有技術，本發明具有以下有益效果:
[0019]本發明中所采用的米根霉菌Rhizopus oryzae CICC41160突變菌株是通過同位素6°Co輻照誘變結合丙烯醇平板和氟乙酸平板篩選的乙醇脫氫酶和乙醛酸循環缺陷型菌株。突變株-2能夠很好利用玉米秸桿水解液發酵產L-蘋果酸，且富馬酸、琥珀酸、乙醇含量有明顯下降。突變株-2與初始菌株相比，L-蘋果酸產量增加了 51.76%，富馬酸產量減少了90.12%，琥珀酸產量減少了 81.34%，乙醇產量為O。以玉米秸桿計，L-蘋果酸的產率3%，僅次于葡萄糖。
四、【附圖說明】
[0020]圖1為本發明制備L-蘋果酸的工藝流程圖。
[0021]圖2為L-蘋果酸的定性分析圖譜，A為標準品圖譜，B為樣品圖譜。
[0022]圖3為突變菌株選育的內部機制圖。
[0023]圖4為不同碳源為原料發酵產L-蘋果酸結果比較。五、
【具體實施方式】
[0024](一 )、米根霉菌突變株-2的選育
[0025]1.菌株誘變篩選:利用同位素6°Co對出發菌株Rhizopus oryzae CICC41160進行誘變，誘變劑量10?30Gy，輻照時間為20min。輻射結合丙烯醇濃度為6ml/L平板篩選得突變株-1。將突變株-1再次6°Co輻照(10?30Gy，20min)后接種于氟乙酸質量濃度7g/L的平板上篩選得突變株_2，該菌株即為突變菌株，用于后續發酵。
[0026]2.突變菌株活化培養:將突變菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)中32°C培養l-2d，挑取菌落稠密、菌絲生