培育熒光蛋白mCherry標記微管蛋白的轉基因植物的方法及其相關生物材料的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及培育熒光蛋白mCherry標記微管蛋白的轉基因植 物的方法及其相關生物材料。
【背景技術】
[0002] 植物微管骨架是植物細胞骨架的一種組織形式，在植物細胞生長、細胞分裂、囊 泡運輸、細胞器運輸、細胞壁合成以及生物和非生物脅迫反應等方面發揮著至關重要的作 用。植物細胞中形成了一些植物特有的微管陣列，比如周質微管（Cortical Microtubules, CMTs)、早前期帶（Preprophase Band，PPB)和成膜體（Phragmoplast)。PPB、中心體、紡錘 體微管和成膜體參與細胞有絲分裂，周質微管與細胞形態密切相關。
[0003] 在許多研究中，需要將微管與生物過程聯系起來，因此微管的可視化是當務之 急。早期的研究中為了觀察到微管采用免疫組織化學法，先用微管抗體結合微管，再用 帶熒光標記的二抗處理，這樣使用熒光顯微鏡就能觀察到熒光抗體標記的微管（Ueda K， Matsuyama T and Hashimoto T(1999)Visualization of microtubules in living cells of transgenicArabidopsis thaliana.Protoplasma206,201-206)。免疫法雖然可行，但存 在操作復雜和只能使用經過固定細胞的缺點。操作復雜會提高實驗成本和影響結果精確 性，經過固定的細胞已經死亡，無法觀察微管實時動態。如果能在活細胞中觀察到微管的動 態，就更能深刻了解微管與生物現象之間的關系。
[0004] 起初研究人員將羅丹明（Rhodamine) (Tanaka E and Kirschner M W (1995) The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. The Journal of cell biologyl28,127-137)或突光黃（Fluorescein) (Zhang D，Wadsworth P and Hepler P K(1990)Microtubule dynamics in living dividing plant cells ：confocal imaging of microinjected fluorescent brain tubul in. Proceedings of the National Academy of Sciences87,8820-8824)結合到微管蛋白上，用顯微注射法打入活細胞內。這 種方法雖然能夠標記活細胞微管，但只有少數顯微注射細胞能夠使用，而且顯微注射費時 費力導致效率不高。
[0005] 自從下村修等人1962年在多管水母（Aequoreavictoria)發現綠色突光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)以來，GFP廣泛用于標記活體細胞中的各類蛋白。1997 年首次在酵母活細胞內觀察到GFP標記的微管，是通過基因工程構建出融合GFP的微管蛋 白實現的。Straight等人通過這項新技術觀察到酵母細胞中紡錘體動態變化（Straight A F, Marshall ff F, Sedat J ff and Murray A ff (1997)Mitosis in living budding yeast ： anaphase A but no metaphase plate. Science277,574-578)。Marc 等人在高等植物香 豆中首次構建出誘導性瞬時表達的GFP-MAP4蛋白（Marc J，Granger C L，Brincat J，Fi sher D D, Kao T~H, Mccubbin A G and Cyr R J (1998)A GFP-MAP4reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. The Plant Cell OnlinelO, 1927-1939)。進一步的人們希望在植物體中獲得穩定表達標記微管 的株系，Ueda等人在擬南芥微管蛋白a (TUA6)的N端融合經過改造的GFP蛋白，用原核生 物35S啟動子作為啟動子表達融合蛋白。通過根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens) 轉化擬南芥，從中篩選穩定表達的純合體植株（Ueda K，Matsuyama T and Hashimoto T(1999)Visualization of microtubules in living cells of transgenicArabidopsis thaliana. Protoplasma206, 201-206)。這一進展具有劃時代意義，使植物中微管相關的研 究進入簡單方便，可以進行準確原位研究的新時代。雖然GFP融合的（！微管蛋白株系可 以在植物體各組織中廣泛標記微管，但是據觀察植株的葉柄和花瓣出現右手螺旋生長表 型。2004年等人對其進行改造，將GFP融合到擬南芥β微管蛋白（At5gl2250)N端，轉基 因擬南芥與野生型表型一致，說明轉入GFP-TUB6基因不影響植物正常生長，唯一缺點是不 在根組織內表達（Nakamura M，Naoi K，Shoji T and Hash imoto T (2004) Low concentrat i ons of propyzami de and oryzalin alter microtubule dynamics in Arabidopsis epidermal cells. Plant and cell physiology45,1330-1334)〇
[0006] 隨著活體熒光標記技術的發展，單一熒光無法滿足同時觀察微管結合蛋白和微管 動態的目的，多種熒光蛋白被嘗試運用到微管蛋白融合。Paredaz將CFP與α微管蛋白 融合，得到CFP :TUA1經過442nm的HeCd激光激發，缺點是由于TUAl表達量過高，導致形 成高的背景值（Paredez A R，Somerville C R and Ehrhardt D W(2006)Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science312,1491-1495)。2010 年 Nakamura 等人用 mCherry 取代了 GFP-TUB6 (2004)中的 GFP，轉入野生型擬南芥，得到株系與GCP2-GFP和GCP3-GFP雜交得到雙熒光穩定表達株系 (Nakamura M,Ehrhardt D ff and Hashimoto T(2010)Microtubule and katanin-dependent dynamics of microtubule nucleation complexes in the acentrosomal Arabidopsis cortical array. Nature CellBiologyl2,1064-1070)。但是由于使用的是 35S 作為強啟動 子，在轉基因后代株系中經常出現基因沉默現象，表現為融合蛋白的表達不穩定，出現有的 細胞表達有的不表達的嵌合表達現象，嚴重影響顯微觀察。特別是作為熒光標簽株系，一般 情況都要在另外一個（或更多）突變體或轉基因背景下觀察，這種基因沉默現象就更為嚴 重，經常導致熒光蛋白不表達，嚴重限制了熒光蛋白標簽株系的應用。因此，目前急需一種 高效、穩定表達的微管標簽株系應用于植物細胞生長、細胞分裂、囊泡運輸、細胞器運輸、細 胞壁合成以及生物和非生物脅迫反應等方面的研究。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種培育熒光蛋白mCherry標記微管蛋白的轉基因植物的 方法，該方法得到的熒光蛋白mCherry標記微管蛋白的轉基因植物在所有的葉表皮細胞、 所有的葉表皮保衛細胞、所有的根尖分生區細胞、所有的下胚軸細胞和所有的花絲細胞均 表達融合蛋白mCherry-TUB6,不存在有的細胞表達融合蛋白mCherry-TUB6,有的細胞不表 達融合蛋白mCherry-TUB6的情況。
[0008] 本發明所提供的培育熒光蛋白mCherry標記微管蛋白的轉基因植物的方法包括 向受體植物中導入名稱為Ptim : :mCherry-TUB6的DNA分子，得到突光蛋白mCherry標記 微管蛋白的轉基因植物；所述名稱為Ptijb6 : :mCherry-TUB6的DNA分子由mCherry-TUB6融 合基因和啟動所述mCherry-TUB6融合基因轉錄的啟動子Ptub6連接而成；mCherry-TUB6融 合基因是編碼融合蛋白mCherry-TUB6的基因，融合蛋白mCherry-TUB6是將所述熒光蛋白 mCherry與植物微管蛋白進行融合得到的蛋白質；
[0009] 本發明中啟動子Ptub6是如下a)、b)或c)的DNA分子：
[0010] a)核苷酸序列是SEQ ID No. 1的1位3004DNA分子；
[0011] b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的 DNA分子；
[0012] c)在高嚴謹條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0013] 所述熒光蛋白mCherry可為如下Al)或A2)的蛋白質：
[0014] Al)由序列表中序列2的第1位到236位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0015] A2)將序列表中序列2的第1位到236所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加且發熒光的的蛋白質。
[0016] 所述植物微管蛋白可為TUB6,所述TUB6可為如下BI)或B2)的蛋白質：
[0017] BI)由序列表中序列2的第241位689位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0018] B2)將序列表中序列2的第241位689位所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基 酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物微管相關的蛋白質。
[0019] 所述融合蛋白mCherry-TUB6是如下Cl)或C2)的融合蛋白：
[0020] Cl)所述融合蛋白mCherry_TUB6中所述突光蛋白mCherry位于所述植物微管蛋白 的氨1基端；
[0021] C2)所述融合蛋白mCherry_TUB6中所述突光蛋白mCherry位于所述植物微管蛋白 的羧基端。
[0022] 所述融合蛋白mCherry_TUB6如下Dl)或D2)的蛋白質：
[0023] 為了使六1)、六2)、81)、82)、(：1)、02)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列2 所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0024] 表1標簽的序列
[0025]
[0026]
[0027] 與所述Ptub6 : :mCherry-TUB6相關的生物材料也屬于本