苯并噁唑酮類化合物水解酶、編碼該酶的基因、含有該基因的工程菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及苯并噁唑酮類化合物水解酶、編碼該酶的基因、含 有該基因的工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 苯并噁唑酮（BOA)類化合物是存在于禾本科、爵床科、毛莨科、玄參科等植物中特 有的化學成分，這類成分對細菌、真菌、昆蟲等具有防御作用，同時具有除草、植物生長調 節和昆蟲拒食等生物活性。BOA類化合物作為一種重要的藥物中間體，常被用于抗菌藥、解 熱鎮痛藥、催眠藥等的合成與生產，例如：6-氯-苯并噁唑酮具有抗菌活性，5-氯-苯噁唑 酮（氯唑沙宗）具有抗炎活性，臨床上用于治療各種急慢性軟組織扭傷、挫傷及慢性筋膜 炎等。此外，BOA類化合物作為新農藥開發的先導化合物被廣泛研究，噁唑禾草靈，噁唑酰 草胺，伏殺硫磷等都是已經商品化并廣泛使用的農藥品種。但是，由于以BOA類化合物作為 活性結構的藥物和農藥的大量使用，將會嚴重污染生態環境，破壞生態平衡。
[0003] 環境污染物的降解主要依賴于土壤中微生物的作用，而微生物對物質的降解主要 由細胞內的酶來完成。微生物是各種酶的重要來源。通過從環境中分離產酶微生物，利用 分子克隆技術從產酶微生物中克隆產酶基因，再將其與合適的載體連接并轉入相應宿主細 胞，可進行酶的大量表達。通過基因工程技術手段進行生產酶，已經成為工業用酶的主導。 因此，篩選能夠高效降解BOA類化合物的菌株并研究其代謝機制，對降解基因資源的開發 利用和環境污染修復非常具有現實意義。
[0004] 目前僅有少數致病真菌對BOA類化合物具有抗性，例如，小麥冠腐鐮刀菌 (Fusarium pseudograminearum)、禾谷鏡刀菌(Fusarium graminearum)、輪狀鏡刀菌 (Fusarium verticillioides)等，因此，闡述清楚致病真菌對BOA類化合物的脫毒機制尤 為重要。研究認為致病真菌對BOA的脫毒過程為：首先BOA在一種β -內酰胺FDBl的作用 下轉化為鄰氨基苯酚，然后再由N-乙酰轉移酶FDB2的作用下生成無毒性的Ν-(2-羥基苯 基）丙酰胺酸，鄰氨基苯酚也可以被轉化為2-乙酰基氨基苯酚。目前對編碼FDB2的基因 已有明確報道，但是對FDBl對BOA的轉化作用僅為一種推測。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對BOA類化合物嚴重污染環境的問題，提供一株該類化合物降 解菌株。
[0006] 本發明的另一目的是提供該菌株中克隆得到的降解BOA類化合物的基因、該基因 編碼的酶、含有該基因的重組表達載體以及含有該基因的工程菌。
[0007] 本發明的又一目的是提供上述菌株、基因、酶、工程菌的應用。
[0008] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0009] -種苯并噁唑酮類化合物水解酰胺酶基因 CbaA，其特征在于，核苷酸序列為：SEQ ID No. 1。該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為1020bp，G+C含量為51. 57%，編 碼339個氨基酸，其氨基酸序列為：SEQ ID No. 2。
[0010] 所述的苯并噁唑酮類化合物水解酰胺酶酶基因核苷酸序列所編碼的BOA類化合 物水解酰胺酶蛋白質，其氨基酸序列為：SEQ ID No. 2。一種來自于菌株Pigmentiphaga sp. VL-I中的BOA類化合物水解酰胺酶CbaA通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換 層析和Butyl-650M疏水層析等蛋白質純化手段，被純化19倍，回收率達到4%。CbaA純酶 在堿性條件下穩定性較好，溫度穩定性強，在pH 7. 0-11. 0,40°C以下儲存24h，酶活力僅損 失不到30% ;EDTA對酶活無顯著影響，表明該酶是不依賴金屬離子的非金屬酶。CbaA的最 適底物為6-氯苯并噁唑酮，比酶活力為5650U · mg protein \ Km值為0· 36 μ mol，Vmax為 10. 94。CbaA同時對苯并嚼唑酮、6-氯苯并嚼唑酮、5-氯苯并嚼唑酮、4-羥基-苯并嚼P坐 酮、6-甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨基-苯并噁唑酮、6-溴-苯并噁挫 酮、5-溴-苯并噁唑酮等具有酶活性，表明CbaA可能為一種酰胺酶并且對苯并噁唑類化合 物有較好的酶活性。
[0011] 一種含有本發明所述的苯并噁唑酮類化合物水解酰胺酶基因 cbaA的重組表達載 體。
[0012] 所述的重組表達載體，優選出發載體為pET_29a(+)。
[0013] 含所述的BOA類化合物水解酰胺酶基因的基因工程菌Escherich coli BL21(DE3) 〇
[0014] 所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)的構建方法：所述的含BOA類化合物 水解酰胺酶基因的pET-29a-cbaA重組質粒轉化到表達宿主菌E. Co I i BL21 (DE3)獲 得重組微生物E. coli BL21 (DE3-pET-29a-cbaA)，再將所獲得的重組菌株E. coli BL21 (DE3-pET-29a-cbaA)轉接到含有50mg/l卡那霉素和24mg/l IPTG的平板，37°C培養 16h后，挑取轉化子驗證降解BOA的能力，經測序驗證基因序列無誤后，保存。
[0015] 本發明所述的基因 cbaA在水解苯并噁唑酮類化合物中的應用；所述的苯并噁唑 酮類化合物優選自苯并噁唑酮、6-氯苯并噁唑酮、5-氯苯并噁唑酮、4-羥基-苯并噁唑酮、 6_甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨基-苯并噁唑酮、6-溴-苯并噁唑酮、 5_溴-苯并噁唑酮中的任意一種。
[0016] 本發明所述的苯并噁唑酮類化合物水解酶CbaA在水解苯并噁唑酮類化合物中的 應用，所述的苯并噁唑酮類化合物優選自苯并噁唑酮、6-氯苯并噁唑酮、5-氯苯并噁唑酮、 4-羥基-苯并噁唑酮、6-甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨基-苯并噁唑 酮、6-溴-苯并嚼唑酮、5-溴-苯并嚼唑酮中的任意一種。
[0017] 本發明所述的基因工程菌E. coli BL21 (DE3-pET-29a_cbaA)在水解苯并噁唑酮類 化合物中的應用，所述的苯并噁唑酮類化合物優選自苯并噁唑酮、6-氯苯并噁唑酮、5-氯 苯并噁唑酮、4-羥基-苯并噁唑酮、6-甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨 基 -苯并嚼唑酮、6-溴-苯并嚼唑酮、5-溴-苯并嚼唑酮中的任意一種。
[0018] -株降解苯并噁唑酮類化合物的細菌Pigmentiphaga sp. VL-I，保藏于中國典型 培養物保藏中心，保藏日期為2014年3月3日，保藏編號為CCTCC NO :M2014057。
[0019] 本發明所述的細菌Pigmentiphaga sp. VL-I在降解苯并噁唑酮類化合物中的應 用；所述的苯并噁唑酮類化合物優選自苯并噁唑酮、6-氯苯并噁唑酮、5-氯苯并噁唑酮、 4-羥基-苯并噁唑酮、6-甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨基-苯并噁唑 酮、6-溴-苯并嚼唑酮、5-溴-苯并嚼唑酮中的任意一種。
[0020] 本發明所述的一種BOA類化合物水解酶在環境的生物修復、工業廢棄物的處理、 食品加工、醫藥、洗滌等行業的應用。
[0021] 本發明的有益效果如下：
[0022] 1.本發明以6-氯苯并噁唑酮為唯一碳源從土壤中分離篩選到一株高效降解BOA 類化合物的菌株Pigmentiphaga sp. VL-1，并以該菌株為材料成功純化出苯并噁挫酮水解 酰胺酶CbaA (Β0Α類化合物降解的起始酶），該酶能高效水解BOA類化合物6-氯苯并噁唑 酮、5-氯苯并嚼唑酮、苯并嚼挫酮等。
[0023] 2.本發明成功從菌株Pigmentiphaga sp. VL-I基因組中克隆到苯并噁挫酮水解 酰胺酶基因 cbaA，并構建該基因的重組表達菌株E. coli BL21 (DE3-pET-29a-cbaA)，該重組 菌株仍然可以水解BOA類化合物，生產的酶制劑可用于環境的生物修復、化工廢棄物處理、 食品加工、醫藥和洗滌等行業。
【附圖說明】
[0024] 圖1基于16S rRNA基因構建的菌株VL-I系統發育樹
[0025] 圖2菌株VL-I降解苯并噁唑酮過程中的降解曲線和生長曲線
[0026] 圖3苯并噁唑酮水解酶的純化和鑒定流程圖
[0027] 圖4 CbaA與PDB數據庫中相似氨基酸序列比對分析
[0028] 圖5 pH對CbaA酶活性和穩定性的影響
[0029] 圖6溫度對CbaA酶活性和穩定性的影響
[0030] 圖7金屬離子對CbaA酶活性的影響
[0031] 圖8重組表達菌株靜息細胞轉化苯并噁唑酮 [0032] 生物材料保藏信息
[0033] Pigmentiphaga sp. VL-1,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2014年 5月17日，保藏地址為中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC No. M 2014057。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施對本發明進一步詳細的描述，但發明的實施方式不限于此。
[0035] 實施例1 :