一種改造后的熒光素酶基因、含該基因的重組載體、工程菌及其構建方法和發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵技術領域，涉及一種改造后的熒光素酶基因，具體涉及含該基因的重組載體、該載體的構建方法、含有該載體的工程菌以及該工程菌生產熒光素酶的方法。
【背景技術】
[0002]熒光素酶(firefly luciferase, LUC)是生物體內催化熒光素或者脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱。螢火蟲熒光素酶是一種能將化學能轉化為光能的高效生物催化劑。早在1884年，Dubois發現將螢火蟲研磨后熒光很快會消失，添加螢火蟲尾部的新鮮提取物后又能重現熒光。此后，他證實提取物中存在熒光素和熒光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的條件下，蟲光素酶可催化熒光素氧化并發出便于靈敏檢測的熒光。化學反應如下:
[0003]熒光素+ΑΤΡ+02 =氧化熒光素+AMP+PPi+CO 2+光
[0004]在有過量酶和過量底物存在的條件下，發光強度與反應中存在的ATP量成正比。這種發光特性使得螢火蟲熒光素酶在各種測定ATP的研究和生產中廣泛使用，目前，螢火蟲熒光素酶已被用作生物傳感器，開發成ATP快速檢測試劑盒，用于快速檢測血液、奶粉、食品生產線、醫療環境等樣本中污染的細菌細胞。目前市場上所售的熒光素酶多從螢火蟲尾部提取，易受到地域和季節的限制，且繁殖周期長，養殖成本高，后處理還要經過離心分離，柱層析純化等多個化學提取步驟，才能得到最終結晶制劑。利用基因工程菌發酵生產熒光素酶具有周期短、不受季節、地域影響、成本低、過程易于規范控制等諸多優點，受到了人們的廣泛關注。早在1985年，JefTery等人首次克隆了螢火蟲熒光素酶基因，并構建了含蟲光素酶基因的重組載體pkwlOl，在E.coli中成功實現表達，獲得了具有活性的熒光素酶。1993年，Lu等人構建了一株可高效分泌熒光素酶的大腸桿菌，從而使得基因工程菌規模化生產熒光素酶成為可能。目前，Promega, Sigma以及沈陽中科靚馬公司已相繼推出來自于大腸桿菌基因工程菌的熒光素酶。但與來自于螢火蟲的熒光素酶相比，利用基因工程的方法生產的熒光素酶存在蛋白含量低，熱穩定性較差等缺陷，嚴重制約了熒光素酶的應用。本發明利用基因工程的方法對螢火蟲熒光素酶進行改造，構建新的熒光素酶基因工程菌，實驗結果表明，本發明所構建的基因工程菌有效克服了目前基因工程方法生產熒光素酶的穩定性差，表達量低的缺陷。
【發明內容】
[0005]為了克服目前螢火蟲熒光素酶生產受到地域和季節的限制，以及繁殖周期長、養殖成本高等缺點，本發明的首要目的在于提供一種含螢火蟲熒光素酶基因的基因工程菌的構建方法，利用該工程菌能高產量地獲得穩定性高的螢火蟲熒光素酶。
[0006]本發明的目的通過以下技術方案實現
[0007]1.本發明提供一種改造后的熒光素酶基因，該熒光素酶基因fl核苷酸序列由螢火蟲熒光素酶核苷酸序列改造而成，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]2.本發明還提供含有上述I提供的重組表達載體。
[0009]3.上述2提供的重組表達載體，該重載載體是pET22b_fl，在原始載體pET22b的NdeI和XhoI位點間插入改造后的熒光素酶基因fl。
[0010]4.上述2提供的重組表達載體，該重組載體是pET22b-fl-linker-aox，通過linker連接米根霉aox基因片段fl-linker_aox導入原始載體pET22b中獲得重組載體，fl-linker-aox 序列如 SEQ ID N0.2 所不。
[0011]5.上述4提供的重組載體pET22b-fl-linker_aox的構建方法，包括如下步驟:
[0012](I)以熒光素酶基因fl為模板，設計引物I和引物2，通過PCR的方法獲得一端連有linker的熒光素酶基因fl的PCR產物；
[0013](2)以米根霉aox基因為模板，設計引物3和引物4，通過PCR的方法，獲得一端連有linker的米根霉aox基因的PCR產物；
[0014](3)將步驟⑴、⑵獲得的PCR產物混合，作為模板，以引物1、4進行PCR獲得fl-linker-aox,膠回收 PCR 產物，連接 PMD19-T Vector,得到重組載體 T_fl-linker-aox。
[0015]6.上述5所述的構建方法，其中，
[0016]步驟(I)所述引物I 序列為 GGAATTCCATATGATGGAAGACGCC,
[0017]引物2 的序列 TTACAAITTGGACTTGGCGGTGGCG
[0018]步驟(2)所述引物3序列為GGCGGTGGCG ATGCCGTACGACATG，引物4序列CCGCTCGAGTTATGCTGTCGATGGG
[0019]7.本發明還提供一種產熒光素酶的工程菌，該工程菌由上述2-4任一項所述載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得。
[0020]8.本發明還提供一種高穩定生產熒光素酶的方法，該方法包括如下步驟:(I)將重組表達載體pET22b-fl-linker-aox轉入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得產熒光素酶工程菌El ；
[0021](2)將工程菌El轉接于加有luL/ML的AMP的新鮮液體LB培養基，200rmp/min、37°C進行搖瓶培養，培養時間為12-14小時，獲得種子液；
[0022](3)將步驟(2)獲得的種子液以體積比3-5%的量接于NBS發酵罐，37°C發酵培養，通過關聯通氣量及轉速控制溶氧在20% -40%，當葡萄糖消耗完后流加新鮮料液，發酵培養產熒光素酶工程菌El獲得熒光素酶。
[0023]9.上述8提供的高穩定生產熒光素酶的方法，其中，步驟(3)進行發酵培養的培養基為:大豆蛋白胨10?12g/L，葡萄糖10?20g/L,Na2HPO4 4?6g/L,K2HPO4 I?3g/L，NH4Cl 0.5 ?lg/L，NaCl 0.1 ?0.5g/L，MgSO4.7H20 0.1 ?0.5g/L。
[0024]有益效果:
[0025]1.本發明利用大腸桿菌的偏愛密碼子，對螢火蟲熒光素酶進行了密碼子優化，利于該熒光素酶基因能在后期大腸桿菌工程菌中順利高效表達。
[0026]2.本發明獲得的pET22b-fl-linker-aoX，由于螢火蟲熒光素酶基因處于高效啟動子PT7及乳糖操縱子IacOperator的控制之下，在IPTG存在時，本發明的螢火蟲熒光素酶能被高效誘導轉錄，并且轉錄得到的mRNA含有核糖體結合位點RBS。
[0027]3.本發明在重組表達載體pET22b_fl基礎上通過linker連接引入來源于絲狀真菌米根霉的aox基因，從而在大腸桿菌體內引入了一條有別于標準呼吸鏈的交替氧化途徑，能夠有效減少氧脅迫的作用，降低體系ROS水平，解除對細胞的毒害，促進了細胞的表達，從而提尚酶的廣量和穩定性。
[0028]總之，利用該工程菌發酵生產熒光素酶的方法，與現有的生產方法相比本方法具有酶的表達量高，穩定性強等優點，是一種高效的生產熒光素酶的方法，適于工業生產應用。
【附圖說明】
[0029]圖1 f l-linker-aox 構建過程；
[0030]圖2 pET22b-f 1-1 inker-aox 構建過程；
[0031]圖3 pET22b_f 1-1 inker-aox 重組載體電泳圖；
[0032]M 表不 Marker, 1、2、3、4、5、6 表不 pET22b-f 1-1 inker-aox 重組載體
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域的公知手段。
[0034]實施例1:
[0035]1、螢火蟲熒光素酶基因的獲得
[0036]根據北美螢火蟲熒光素酶的基因序列，在不改變其氨基酸序列的前提下，對其進行密碼子優化，以適應大腸桿菌的表達體系，人工直接合成該基因(金斯瑞生物公司)，命名為熒光素酶基因fl。將該基因與PMD-19T(TAKARA)連接，反應條件如下:總體積5uL，PMD19-T載體luL，DNA luL，ddH203uL，16°C，反應30min以上，測序(金斯瑞生物公司)。測序結果表明獲得的熒光素酶基因fl核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，重組后的載體含有熒光素酶基因fl，命名為T-fl。
[0037]2、螢火蟲熒光素酶基因重組載體pET22b_f 1-1 inker-aox
[0038](I)以熒光素酶基因fl的基因組DNA為模板，設計引物I和引物2，通過PCR的方法獲得一端連有linker的熒光素酶基因fl的PCR產物fl_linker ；
[0039]PCR 體系為:2 X Taq Plus master mix (Taq 酶預混合溶液)12.5uL，模板 DNA2uL，引物I luL，引物2 luL，ddH20 8.5uL。PCR反應進程為:I)95°C預變性5min ;2)94°C預變性30s ;3)55°C退火30s ;4)72°C延伸1.5min ;步驟2)-4)重復29個循環；5)72°C繼續延伸7min，冷卻至4°C。膠回收PCR產物。
[0040](2)以aox的基因組DNA為模板，設計引物3和引物4，通過PCR的方法(退火時間按1000bp/min設計，其余同上)，獲得一端連有linker的米根霉aox基因的PCR產物Iinker-aox ；
[0041]以下為上述1-4所述引物序列，直線部分為linker，波浪線部分為酶切位點:
[0042]引物1:上游引物 GGAATTCCATATGATGGAAGACGCC
[0043]引物2:下游引物 TTACAAITTGGACTTGGCGGTG