虹鱒魚脂肪酸延長酶基因、重組表達載體、應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種虹鱒魚脂肪酸延長酶基因及其編碼蛋白、重組載體，以及增加蠶 蛹組織11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，屬于基因工程、轉基因動物育種領域。
【背景技術】
[0002] 脂肪酸按不飽和度不同可以分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸是和多不飽和脂肪 酸（PUFAs)。在生物體內，許多代謝過程都在膜上進行或與膜有關，而不飽和脂肪酸是細胞 膜磷脂的重要組成成分。由于脂肪酸的凝固點隨其不飽和度升高而降低，因此膜脂中的不 飽和脂肪酸含量越高，其相變溫度越低，流動性越大。進而，細胞膜的各種功能，如細胞識 另IJ、轉運作用和膜結合酶的活性等等都和細胞膜的流動性密切相關，因此不飽和脂肪酸在 生物體內直接或間接的發揮著重要的功能，如抗癌抗腫瘤活性、免疫調節活性、促生長發育 活性和降低膽固醇活性等。
[0003] 多不飽和脂肪酸對人體的生理功能有著重要的生理意義，其功能的研究一直備受 關注。其中，亞油酸（linoleic acid，LA)和α-亞麻酸（a-Linolenic acid, ALA)被認為 是人類飲食中的必需脂肪酸。更長鏈的PUFAs，如二十碳五稀酸（eicosapentaenoic acid， EPA)和二十二碳六稀酸（docosahexenoic acid，DHA)等在人體的新陳代謝中發揮著至關 重要的作用。
[0004] 家蠶是重要的經濟昆蟲。蠶蛹不僅是優質的飼料蛋白源，而且富含豐富的不飽和 脂肪酸。家蠶組織內，脂肪酸占干重的約30%，其中不飽和脂肪酸約占70%，以α-亞麻酸 為主。但是目前蠶蛹的加工利用方式主要是用于家畜飼料的蛋白源添加組分，其組織中脂 肪酸成分利用非常有限。因此，提高蠶蛹不飽和脂肪酸含量尤其是主要的亞油酸和α亞麻 酸含量對蠶蛹的進一步綜合利用有著重要意義。近幾年來，家蠶轉基因技術的建立以及成 熟使家蠶成為了新型的真核生物反應器，已有研究者通過將家蠶作為反應器成功的表達了 多種高附加值產物，如人成纖維細胞生長因子、貓干擾素和人III型前膠原蛋白等。然而用家 蠶轉基因技術在家蠶體內表達外源脂肪酸去飽和酶基因，增加家蠶組織中某特定不飽和脂 肪酸含量的研究還未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的就是提供一種虹鱒魚脂肪酸延長酶基因、由該基因指導編碼的蛋 白，以及由該基因重組表達載體實現的提高蠶蛹組織11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的 方法。為實現上述目的，本發明技術方案分別如下：
[0006] 本發明首先提供一種虹鱒魚脂肪酸延長酶基因。
[0007] -種虹鱒魚脂肪酸延長酶基因，命名為OmElo基因，其特征在于：核苷酸序列如 SEQ ID No. 1。
[0008] 上述虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo是根據家蠶基因組序列數據中編碼基因表 達序列密碼子的偏好性，對來源于虹鱒魚的脂肪酸延長酶基因（OmElo)序列（NCBI登陸 號：NP_001118108. 1)進行優化設計，優化后獲得新的去飽和酶基因，命名為OmElo,其核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 由上述虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo指導編碼的蛋白質，其技方案如下：
[0010] -種由上述虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo指導編碼的蛋白質，其特征在于：氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 上述由OmElo基因指導編碼的蛋白能夠以特定碳鏈長度及不飽和度的脂酰輔酶A 作為底物，在羧基端增加一個二碳單位，從而對碳鏈進行延長。
[0012] 利用上述OmElo基因可以得到重組載體、表達盒、轉基因細胞系統或重組菌株，其 技術方案如下：
[0013] -種包含核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達載體或基因表達盒或轉基因細胞 系或重組菌株。
[0014] 上述重組表達載體，其表達框的啟動子是BmNPV極早期啟動子IEl。
[0015] 進一步地，上述重組表達載體是以家蠶肌動蛋白3的啟動子A3啟動的加強型綠 色熒光蛋白（EGFP)作為表達盒，加強型綠色熒光蛋白作作為篩選標記，篩選標記后帶有以 IEl啟動子啟動虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo的表達盒。
[0016] 本發明還提供構建包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達載體的方法。
[0017] 構建包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達載體的方法，其特征在于：是將 所述OmElo基因插入到出發載體pSLllSO的多克隆位點得到中間載體，然后再將完整的含 有OmElo基因的表達盒IEl-0mEl〇-SV40插入到最終載體pBac[A3-EGFP]得到重組表達載 體。
[0018] 上述重組表達載體在獲得蠶蛹組織高11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量家蠶轉基 因品系中的應用。
[0019] 本發明還提供提高蠶蛹組織中11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，其技術 方案如下：
[0020] 提高蠶蛹組織中11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量的方法，其特征在于：將虹鱒魚 脂肪酸延長酶基因 OmElo導入家蠶胚胎中，經篩選，得到目標家蠶轉基因系。
[0021] 進一步地，上述方法，是利用piggyBac重組表達載體將所述OmElo基因整合入 家蠶基因組，重組表達載體是將含有OmElo基因的表達盒插入到載體pBac[A3-EGFP]的 Bgl II酶切位點得到。
[0022] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：（1)設計優化并人工合成了適用于家蠶 體內表達的虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo。（2)根據家蠶基因組序列數據中內源編碼序 列密碼子的偏好性，對虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo序列進行了優化設計，使人工合成 的OmElo基因更有利于在家蠶個體中表達。（3)提供了包含核苷酸序列如SEQ ID No. 1的 重組表達載體或基因表達盒或轉基因細胞系或重組菌株。（4)包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1的重組表達載體可應用于獲得高11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量家蠶轉基因品系。 (5)利用piggyBac轉座子結合BmNPV極早期啟動子IEl驅動其表達，從而獲得了可穩定在 家蠶中表達虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo的家蠶轉基因系，該品系蠶蛹期組織含有高含 量11，14, 17-順-二十碳三烯酸。
【附圖說明】
[0023] 圖1是真核生物多不飽和脂肪酸合成途徑。
[0024] 圖 2 是重組載體 pBac[A3-EGFP+IEl-0mEl0-SV40]結構圖。
[0025] 圖3是轉基因家蠶的鑒定圖。
[0026] 圖4是非轉基因305多化品系蛹期3天脂肪酸甲酯的氣相色譜圖。
[0027] 圖5是305多化品系家蠶虹鱒魚脂肪酸延長酶基因（OmElo)品系蛹期3天脂肪酸 甲酯的氣相色譜圖。
[0028] 圖6是305多化品系家蠶轉虹鱒魚的脂肪酸延長酶基因（OmElo)品系和非轉基因 305多化品系蛹期3天脂肪酸的11，14, 17-順-二十碳三烯酸含量變化圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合附圖，對本發明的優選實施例作進一步的描述。
[0030] 實施例一
[0031] 虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo的制備。
[0032] 來源基因：虹鱒魚的脂肪酸延長酶基因（OmElo)序列（NCBI登陸號： NP_001118108. 1) 〇
[0033] 根據家蠶基因組序列數據中編碼基因表達序列密碼子的偏好性，對來源基因進行 優化設計，優化后得到虹鱒魚脂肪酸延長酶基因 OmElo,核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，命 名為OmElo基因。
[0034] 由OmElo基因指導編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0035] 實施例二
[0036] 構建家蠶轉基因重組載體 pBac [A3-EGFP+IEl-0mEl0-SV40]。
[0037] 如圖2所示，將OmElo基因插入到出發載體pSL1180的多克隆位點得到的中 間載體，然后再將完整的含有OmElo基因的表達盒IEl-0mEl〇-SV40插入到最終載體 pBac[A3-EGFP]得到重組表達載體。
[0038] 具體實施操作：
[0039] 步驟 S1、制備載體 pSL1180[Serl-0mEl0-SV40]
[0040] 將OmElo基因連接于pUC57載體質粒；通過BamH I /Not I雙酶切pUC57載體 質粒，回收得到OmElo基因片段（回收操作按照TAKARA膠回收（小量）試劑盒使用說明 進行），將回收片段與相同酶切的pSL1180 [Ser I-pGH-SV40]載體骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用說明進行連接，即將pGH序列替換為OmElo序列，得到 pSL1180[Serl-0mEl0-SV40]載體。
[0041] 步驟S2、制備IEl啟動子序列
[0042] PCR體外擴增，從BmNPV基因組中擴增IEl啟動子序列，并在擴增片段上下游分別 添加 EcoR I和BamH I酶切位點，經T-A克隆到載體pMD19-T獲得質粒，將獲得的pMD19-T 載體質粒用EcoR I和BamH I雙酶切，回收IEl啟動子序列（回收操作按照TAKARA膠回收 (小量