一種用于分析dna樣本中mlh1啟動子甲基化狀態的試劑盒、方法和引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于分析DNA樣本中MLHl啟動子甲基化 狀態的試劑盒、方法和引物。
【背景技術】
[0002] Lynch綜合征是結腸直腸腸癌（CRC)的遺傳形式，新診斷的CRC患者有2-5%與之 有關。Lynch綜合征是由DNA錯配修復（MMR)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)種系突變造 成的，從而引起高的微衛星不穩定性并且導致MMR蛋白表達缺失。然而，僅有15%的MSI-H CRC與Lynch綜合征相關聯，剩余的85%在起源上大部分是偶發性的，由此錯配修復缺陷是 由MLHl基因的啟動子超甲基化沉默造成的，并且這經常與基因 BRAF突變相結合。因此，與 BRAF V600E突變相結合的MLHl啟動子DNA甲基化已經被認為一種可靠且標準的現有技術 的分子測試，以區分Lynch綜合征和具有MSI-H表型的偶發性CRC并且確定需要基因檢測 的Lynch綜合征相關的CRC患者。作為一種遺傳性結腸癌綜合征，Lynch綜合征的特點以及 與之相關的這些基因標記詳見于H. F. A. Vasen等（2007) J Med. Genet. 44:353-362，M. Gala 等（2011) Semin. Oncol. 38:490-499, R.S. Nelson 等（2009) Curr. Oncol. R印.11:482-489， E. Lastra 等（2012)Clin.Transl.0ncol.l4:254_262，E. Domingo 等（2004)J.Med. Genet.41:664_668 以及 E. Domingo 等（2005)0ncogene 24:3995-3998。
[0003] Lynch綜合征不過是在本發明的范圍內的多種類型的癌癥及非癌腫瘤性疾病。其 他癌癥可包括同樣在本發明的范圍內的子宮內膜癌和胃癌，以及任何未來發現的癌癥或表 現出MLHl基因啟動子超甲基化的其他腫瘤性疾病。
[0004] 存在幾種現有技術的方法來確定MLHl DNA甲基化狀態的組織。然而，這些方法是 非定量的，或者它們使用不專門檢測甲基化MLHl DNA的引物和探針，或不選擇性靶向對于 MLHl表達關鍵的啟動子基因組區域的引物和探針。這些方法詳見于M. Bettstetter (2007) Clin. Cancer Res. 13:3221-3228，C. A.Eads 等（2000)Nucl. Acids Res. 28: e32，K.Rand 等 (2002)Methods 27:114-120, H.Thomassin (2004) Nucl. Acids Res. 32: el68 以及 G. Deng 等 (1999)Cancer Res. 59:2029-2023。此外，這些方法都未在大患者群中得到驗證。這些限制 會妨礙科學家和臨床醫生對測試的腫瘤的MLHl甲基化狀態給出明確的解釋。
[0005] 用于分析MLHl甲基化的兩種高引用的方法詳見于M. Bettstetter等（2007)和 C. A. Eads等（2000)。然而，我們已經發現沒有方法對用MLHl蛋白表達和BRAF突變的已知 信息明確確定在CRC腫瘤組中MLHl甲基化提供一貫明確的界限。
[0006] 照慣例，結合MSI分析，MMR蛋白表達，MLHl啟動子甲基化和BRAF突變已被認為是 用于選擇未來基因測試的Lynch綜合征候選項的標準分子測試。E. Lastra等（2012)。然 而，目前可用的測定MLHl DNA甲基化的方法在不同的研究中頻繁地產生不一致的結果，因 此無法應用于診斷目的。MLHl甲基化的不同策略的比較詳見于L. P6rez-Carbonell (2010) J. Mol. Diagn. 12:498-504,該文獻通過引用的方式全部并入本文中。此外，在現在臨床的使 用中，并沒有FDA認準的對MLHl甲基化的標準測試。
[0007] 另外，選擇患者進行基因測試以診斷Lynch綜合征在臨床實踐中具有挑戰性。用 于確定應當測試MSI的人的Amsterdam和Bethesda標準在Lynch綜合征檢測的敏感性和 特異性方面有大量限制，詳見于S.A. Wahlberg等（2002) Cancer Res. 62:3485-3492以及 A. Umar (2004) J. Natl Cancer Inst. 96:261-268。結果，忽視了大量的 Lynch 綜合征患者并 且并沒有錯配修復基因突變的許多患者卻被送去進行基因測試，從而導致不必要地增加患 者的不便以及實驗室開支。因此，需要額外的更特異的測試方法。
[0008] 包括結合MSI的分析、MMR蛋白表達、MLHl啟動子甲基化和BRAF突變的常規測試 已被當作候選未來基因檢測選擇Lynch綜合征的標準分子測試。然而，目前可用的方法是 非定量的，或者它們使用不專門檢測甲基化MLHl DNA的引物和探針，或不選擇性靶向對于 MLHl表達關鍵的啟動子基因組區域的引物和探針。這些限制妨礙對測試的腫瘤的MLHl甲 基化狀態給出明確的解釋并且得出假陽性。
[0009] 因此，需要一種可復制的方法用于明確檢測患者（包括但不限于患有結腸直腸 癌、胃癌和子宮內膜癌的患者）的某些瘤細胞，并且定量測量MLHl啟動子DNA的甲基化 DNA，這種定量測量提供正-負DNA甲基化的離散測量。還需要一種連續測量DNA甲基化水 平及模式方法，以分類并預測癌癥的不同類型及階段、癌癥的治療結果及患者的生存率。
【發明內容】
[0010] 本發明公開了通過以下方式對與一般在個體中的一些癌癥和腫瘤性疾病有關的 差異甲基化MLHl啟動子DNA序列進行識別并定量分析的方法和單管試驗：從個體獲得包含 DNA的生物樣本；檢測甲基化MLHl啟動子序列并且測量其水平；并且將樣本中的甲基化和 甲基化水平與在同一單管反應中擴增的"正常"的β-肌動蛋白基因啟動子的正常化參照 水平作比較，其中，樣本甲基化的水平或模式與正常化參數水平相比的差異識別異常甲基 化MLHl啟動子序列。
[0011] 本發明的第一方面提供了一種用于分析DNA樣本中與腫瘤性疾病相關的MLHl啟 動子甲基化狀態的試劑盒，試劑盒包括寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物與在相對于轉錄 起始位點從-248bp至-178bp的區域中的MLHl啟動子的至少一部分序列互補并且與其中 的甲基化位點重疊。
[0012] 優選的，所述寡核苷酸引物為正向和反向寡核苷酸引物，作為相對于所述轉錄起 始位點從-248bp至-178bp的所述MLHl啟動子區域的至少一部分的側翼，并且其中所述正 向和反向寡核苷酸引物的至少一個在其中的甲基化位點重疊。
[0013] 優選的，所述正向寡核苷酸引物選自由以下組成的組：SEQ ID NO. :1，SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5, SEQ ID NO. :6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 ;
[0014] 所述反向寡核苷酸引物選自由以下組成的組：SEQ ID NO. :2和SEQ ID NO. :9。
[0015] 優選的，所述試劑盒還包括寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針與所述MLHl啟動子 互補，并且在5'端用熒光報告劑標記并且在3'端用熒光淬滅劑標記。
[0016] 本發明的第二方面提供了一種用于分析單管DNA樣本中與腫瘤性疾病相關的 MLHl啟動子甲基化狀態的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0017] 第一對正向和反向寡核苷酸引物，作為相對于所述轉錄起始位點從-248bp 至-178bp的所述MLHl啟動子區域的至少一部分的側翼，并且其中所述正向和反向寡核苷 酸引物的至少一個在其中的甲基化位點重疊；以及
[0018] 第二對正向和反向寡核苷酸引物，所述引物為所述樣本DNA的未甲基化區域的側 翼；所述樣本DNA的未甲基化區域是β-肌動蛋白基因。
[0019] 優選的，所述的試劑盒進一步包括：
[0020] 第一寡核苷酸探針，與所述MLHl啟動子序列互補，并且在5'端用第一焚光報告劑 標記并且在3'端用熒光淬滅劑標記；以及
[0021] 第二寡核苷酸探針，與所述樣本DNA的未甲基化區域互補，并且在5'端用第二熒 光報告劑標記并且在3'端用熒光淬滅劑標記，其中所述第一和第二熒光報告劑不同。
[0022] 本發明的第三方面提供了一種用于分析DNA樣本中與腫瘤性疾病相關的MLHl啟 動子甲基化狀態的方法，包括以下步驟：
[0023] 提供第一對正向和反向寡核苷酸引物，所述第一對正向和反向寡核苷酸引物作為 相對于所述轉錄起始位點從 -248bp至-178bp的所述MLHl啟動子區域的至少一部分的側 翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一個在其中的甲基化位點重疊；并且
[0024] 提供第一寡核苷酸探針，所述第一寡核苷酸探針與所述MLHl啟動子序列互補，并 且在5'端用第一熒光報告劑標記并且在3'端用熒光淬滅劑標記；<