一種腐質霉來源的高溫酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種腐質霉來源的高溫酸性 β -葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是多個葡萄糖殘基以β-l，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重復單 位為纖維二糖。纖維素的利用與轉化對于解決世界能源危機、糧食短缺、環境污染等問 題具有重要意義。纖維素可通過纖維素酶的作用降解為葡萄糖，后者可作為重要的工 業原料來生產酒精、丙酮等化工產品。纖維素酶是能將纖維素降解為葡萄糖的三類酶的 總稱，即內切β-1，4-葡聚糖酶（ end〇-i3-l，4-glucanaSe，EC 3.2. 1.4)、外切葡聚糖酶 (exoglucanase，又稱纖維二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2. 1.91)和 β-葡萄糖昔 酶（β -glucosidase，EC 3. 2. 1. 21)。這三種酶協同作用能夠將纖維素轉化成葡萄糖。
[0003] β-葡萄糖苷酶的分布較為廣泛，特別是植物的種子和微生物中尤為普遍。對微生 物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在絲狀真菌、酵母、細菌、鏈霉菌等。β-葡萄糖苷酶在生 物技術應用和生物轉化方面也有很重要的應用，在纖維素水解為還原糖的過程中，依靠內 切纖維素酶、外切纖維素酶和β -葡萄糖苷酶的協同作用，然而β -葡萄糖苷酶最終把纖維 二糖解離成單個的葡萄糖分子，是整個纖維素降解過程的限速步驟，葡萄糖苷酶活力 較低就會造成纖維二糖的大量積累，積累的纖維二糖對纖維素內切和外切酶有很強烈的抑 制作用，所以葡萄糖苷酶其性質和酶活力的高低在纖維素水解的過程中決定著總體酶 活力。
[0004] 現有微生物來源的β -葡萄糖苷酶pi值大多在酸性范圍內，最適的pH值一般在 3. 5~5. 5之間，可適用于較多酸性水解過程，但不能滿足部分如洗滌劑、造紙和紡織工業 等的中堿性水解過程的應用需求。本發明所提供的來源于特異腐質霉的高溫酸性β-葡萄 糖苷酶HiBgl3C，最適溫度為60°C，最適pH為5. 5,且pH穩定性較好，可耐受堿性環境；對 大多數化學試劑、金屬離子和葡萄糖都具備較好的耐受性，具備可觀的在洗滌劑、生物乙醇 等多種行業的復雜環境下的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種新的高溫酸性β -葡萄糖苷酶。
[0006] 本發明的再一目的是提供編碼上述葡萄糖苷酶的基因。
[0007] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發明的另一目的是提供一種制備上述β -葡萄糖苷酶的基因工程方法。
[0010] 本發明的另一目的提供上述葡萄糖苷酶的應用。
[0011] 本發明從腐質霉中分離得到一種新的高溫酸性葡萄糖苷酶HiBgl3C，其氨基 堿序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] SEQ ID NO. 1 ：
[0013] MGIFGLALLAAAAIARAAPNCPVVPRQASGTAAWDTAYASARAAVARLSQQDKINIVTGIGWERGPCVG NTAPVNSIGYPQLCLQDGPLGIRFATGTTAFTPGVQAASTWDVDLIRQRGEYLGAEARAVGVHVLLGPVAGALGKIP HGGRNWEGFGSDPYLAGICMAETIEAIQSQGVQACAKHYIVNEQEffMRETMSSNVDDRTMHEIYLffPFADAAHSNVA SFMCSYNKINGTWACESDSVQNKLLKQELGFRGYIMSDWNAQHTTVGSANSGMDMTMPGTDFSGGNVLWGPQLNNAV NSGQVSRARLDDMATRILAAWYLVGQDKGYPQVNLRLNVQGNHKENVRAVARDGIVLLRNEGNILPLGRPSRIAVVG SGAVIGRHAQNGCQDKGCNDGALGMGWGSGSVNYPYFVAPYDAIRERASRDGTQVSLHSSDNTNGVQNVVQGADVAI VFITADSGEGYITVEGHP⑶RNHLDPWHNGNQLVQAVAAANKNTIVVVHSTGPIILETILNTPGVRAVVWAGLPSQE NGNAIVDILYGSTSPSGKLVYTIAKRPEDYGVSIVRGDDNFREGVFVDYRWFDQNNIEPRFEFGFGLSYTNFSYSGL SITSNARAGPATGPTIPGGPADLffETVATVTAQITNTGGVAGAEVAQLYLTLPPTAPPAGPRQLRGFTKLKLQPGQT GTATFKLRKRDLSYffDVGRQQffVVPSGRFTISVGASSRDIRLTGSIDV
[0014] 其中，該酶包括734個氨基酸，N端17個氨基酸為其預測的信號肽序列 "MGIFGLALLAAAAIARA"（SEQ ID NO. 3)。
[0015] 因此，成熟的β -葡萄糖苷酶HiBgl3C的理論分子量為78. 4kDa，其氨基酸序列如 SEQ ID Nd 2 所示：
[0016] APNCPVVPRQASGTAAWDTAYASARAAVARLSQQDKINIVTGIGWERGPCVGNTAPVNSIGYPQLCLQD GPLGIRFATGTTAFTPGVQAASTWDVDLIRQRGEYLGAEARAVGVHVLLGPVAGALGKIPHGGRNWEGFGSDPYLAG ICMAETIEAIQSQGVQACAKHYIVNEQEWMRETMSSNVDDRTMHEIYLWPFADAAHSNVASFMCSYNKINGTWACES DSVQNKLLKQELGFRGYIMSDWNAQHTTVGSANSGMDMTMPGTDFSGGNVLWGPQLNNAVNSGQVSRARLDDMATRI LAAWYLVGQDKGYPQVNLRLNVQGNHKENVRAVARDGIVLLRNEGNILPLGRPSRIAVVGSGAVIGRHAQNGCQDKG CNDGALGMGffGSGSVNYPYFVAPYDAIRERASRDGTQVSLHSSDNTNGVQNVVQGADVAIVFITADSGEGYITVEGH P⑶RNHLDPWHNGNQLVQAVAAANKNTIVWHSTGP11 LET ILNTPGVRAWWAGLPSQENGNAIVDILYGSTSPSG KLVYTIAKRPEDYGVSIVRGDDNFREGVFVDYRffFDQNNIEPRFEFGFGLSYTNFSYSGLSITSNARAGPATGPTIP GGPADLWETVATVTAQITNTGGVAGAEVAQLYLTLPPTAPPAGPRQLRGFTKLKLQPGQTGTATFKLRKRDLSYWDV GRQQffVVPSGRFTISVGASSRDIRLTGSIDV
[0017] 本發明提供了編碼上述β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3C。具體地，該基因的DNA序列 如 SEQ ID NO. 4 所示：
[0018] atgggtatcttcggtctcgcattgctggccgccgcggccattgcccgggccgcgcctaactgccctgtg gtgccccgccaggcatcgggcaccgctgcttgggatacggcgtacgcctcggccagagccgccgtggcccggctttc ccagcaggacaagatcaacattgtcaccggtatcggttgggagaggggcccttgcgtcggcaacacggcgcccgtca actccatcggctatcctcagctctgcctccaggacggtcccttgggtattcgcttcgccacgggcacgaccgctttt acccccggtgttcaggcggcgtccacctgggatgttgacctgatccgccagcgtggtgagtacctgggcgcagaggc tcgtgctgtcggtgttcacgtgctgctgggtcctgtggccggcgccctcggcaagattcctcatggtggacgcaact gggagggtttcggctcggacccgtacctcgcgggtatctgcatggctgagaccatcgaggccattcagtcccagggt gtccaggcctgcgccaagcactacattgtcaacgagcaggagtggatgcgtgagacgatgagcagcaatgtcgacga ccgcaccatgcacgagatttacctgtggcccttcgccgatgccgctcactccaacgtggccagcttcatgtgcagct acaacaagatcaacggcacctgggcctgcgagagcgacagcgtccagaacaagcttcttaagcaggagctcggcttc cgcggctacatcatgagcgactggaacgcccagcacaccaccgtcggctccgccaacagcggcatggacatgaccat gcccggcaccgacttcagcggcggcaacgtgctctggggcccgcagctcaacaatgccgtcaactcgggccaggttt cgcgcgcccgtctcgacgacatggccacccgcatcctcgccgcctggtacctggtcggccaggacaagggctacccg caggtcaacctccgcctcaacgtccagggcaaccataaggagaacgtgcgcgctgtggctcgcgacggcatcgttct gctccgcaacgagggcaacatcctcccgctcggccgcccgtctcgcatcgcagtcgtcggctctggtgccgtcatcg gccgccacgcccagaacggctgccaggacaagggctgcaacgacggtgccctcggcatgggctggggctccggttcc gtcaactacccctacttcgtcgccccctatgacgccatccgcgagcgcgccagccgcgatggc