一種釀酒酵母高密度發酵培養的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種釀酒酵母高密度發酵培養的方法，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，又稱面包酵母或出芽酵母，是一種以出 芽生殖為主的單細胞真菌。釀酒酵母是與人類關系最為密切的微生物，酵母工業其具有特 殊的優越性。因為釀酒酵母生長繁殖快，酶活性較強，生產蛋白和生物活性物質的速率是動 植物所不能比擬的。其次，酵母營養豐富，每克干酵母中含有蛋白質50%~60%、碳水化合 物30%~35%、核糖核酸4. 5%~8. 3%、脂肪1 %~5%。此外，還含有豐富的維生素、礦物 質、氨基酸等其它的營養成分。第三，酵母菌生產不受季節、氣候和地區的限制，生產穩定， 發酵產泡沫少，能抗重金屬，環境適應性強。
[0003] 釀酒酵母現已經廣泛應用于食品、制藥和飼料等領域。食品行業中活性干酵母用 于制作面包和饅頭；性狀優良的釀酒酵母用于釀造啤酒、白酒和葡萄酒；制作酵母天然調 味品、酵母蛋白肽等。在生物制藥行業，廢酵母泥用于轉化生產1，6-二磷酸果糖和三磷酸 核苷；酵母高密度發酵提取谷胱甘肽、麥角固醇等活性物質。飼料行業利用廢酵母泥生產培 養微生物的酵母浸膏和酵母提取物，同時酵母菌是用于配制畜類、魚蝦、珍貴毛皮動物的理 想蛋白質原料。
[0004] 由于釀酒酵母的廣泛應用，利用新的發酵工藝對釀酒酵母進行高密度發酵，得到 生產成本低廉、質量穩定的釀酒酵母是勢在必行的。
[0005] 酵母菌的高密度發酵是一個相對概念，一般指發酵液中酵母濃度在30g/L以上。 營養供給不適宜、發酵液中溶解氧不足、生產抑制性物質的積累和發酵液流變學特性的影 響都會限制酵母在發酵液中的積累。
[0006] 在高密度發酵時，隨著菌體的大量積累，發酵液粘度大幅度增加，為非牛頓型流 體，對氧的傳遞和營養物的傳質都產生較大影響。改變這種現象需要通過改變發酵罐的結 構來實現。因此在酵母常規發酵過程中，需要采用精細化的補料策略，才能實現酵母快速生 長和生物量的積累。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種實現釀酒酵母高密度發酵的方法。在發酵前期，利用溶 氧的變化來調節補加培養基的速率，維持菌體生長所需要的營養物質，發酵后期菌體生長 變慢，葡萄糖的利用速率降低，此時逐步降低補料速率，延長發酵周期；在整個發酵過程中 隨著釀酒酵母代謝活躍度增加，菌體量不斷積累，逐步提高攪拌速率和通氣量，能夠保證足 夠的通風，從而實現酵母菌穩定快速的高密度發酵。使用購自中國工業微生物菌種保藏管 理中心的CICC編號為1511或32280的釀酒酵母進行高密度發酵，均得到較好的實驗結果
[0008] 所述方法，是在酵母發酵培養過程中分階段控制培養基補料速率，前期不補料，中 期逐步提高補料速度，后期逐步降低補料速度，同時在中期逐步提高攪拌速率和通氣量。
[0009] 所述方法是：（1)將酵母種子液接入發酵罐中，初始轉速為400rpm，初始通氣量為 4. 5L/min ; (2)當葡萄糖耗盡、溶氧突然提高至30%以上時，開始以8-16mL/h的速率進行補 料，并逐步提高補料速率、攪拌速率和通氣量，直至補料速率提高到80-85mL/h、攪拌速率和 通氣量提高到發酵設備所能達到的最大攪拌速率和通氣量；（3)當酵母生長速率持續降低 達2h以上時，逐步降低補料速率直至發酵結束。
[0010] 所述逐步提尚補料速率，在本發明的一種實施方式中，是指每4h提尚14-25mL/h。
[0011] 所述酵母生長速率持續降低達2h以上時，在本發明的一種實施方式中，是指發酵 28h 時。
[0012] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，包括如下步驟：（1)將酵母種子液接入發 酵罐中，初始轉速為400rpm，初始通氣量為4. 5L/min，發酵培養IOh ; (2) IOh后以8-16mL/ h的速率進行補料，并每4h提高補料速率14-25mL/h ;同時每隔4h將攪拌速率提高IOOrpm 直至達到發酵設備所能達到的最大攪拌速率，每隔4-8h將通氣量提高I. 5-3L/min直至達 到發酵設備所能達到的最大通氣量；(3)保持最大攪拌速率和通氣量進行發酵，當發酵28h 后，按照每4h的降低10-20mL/h的速度逐步降低補料速率，發酵32-36h即停止發酵。
[0013] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，具體是：（1)種子液按10%接種量接種于 發酵罐中進行發酵，培養溫度為30°C，控制pH為5. 5,初始轉速為400rpm，初始通氣量為 4. 5L/min ; (2)發酵IOh后開始以8mL/h速率開始補料，當溶氧突然提高至30 %以上時增加 補料速率，按每4h提高補料速率14-25mL/h直至提高至80-85mL/h ;同時每隔4h將攪拌速 率提高lOOrpm，直至26h攪拌調至800rpm ;發酵14h后將通氣量提高至6L/min，發酵22h后 將通氣量提高至9L/min ; (3)發酵28h后，按照每4h降低10-20mL/h的速度降低補料速率， 發酵32-36h即發酵結束。
[0014] 所述發酵結束，在本發明的一種實施方式中，是發酵34h即結束發酵。
[0015] 所述釀酒酵母，在本發明的一種實施方式中，是購自中國工業微生物菌種保藏管 理中心的CICC編號為1511或32280的釀酒酵母。本發明的方法對釀酒酵母具有普適性， 不僅僅局限于這兩株菌。
[0016] 本發明的有益效果：
[0017] (1)分兩階段控制培養基補料速率，發酵中期根據溶氧變化進行補料速率的逐步 提高，發酵后期根據酵母生長速率逐步降低補料速率；通過逐步提高攪拌速率和通氣量，實 現釀酒酵母快速穩定的生長，常規酵母高密度發酵周期一般在40h以上，本發明采用34h即 可，發酵周期短，提高了發酵罐利用率，降低了能耗，減少了染菌機會；
[0018] (2)發酵控制策略簡單，通過溶氧和生長速率（OD)變化來控制攪拌轉速、通氣量、 補料速率即可，不需要其他特殊檢測裝置，比如殘糖檢測、乙醇監測、尾氣分析等裝置，對 發酵設備要求低，一般工廠的普通發酵設備即可實現高密度發酵，可避免設備改造，降低成 本。同時培養基成分簡單，價格低廉，有利于控制成本。
[0019] (3)該發明所提供的方法對于釀酒酵母具有普適性，得到釀酒酵母產量可達 109.2g/L〇
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例1中釀酒酵母（CICC 1511)發酵過程曲線圖；其中，▲為發酵液的酵 過程中葡萄糖濃度變化曲線，為發酵過程中釀酒酵母細胞干重的變化曲線，?為發酵過 程中發酵液中的乙醇濃度變化曲線；
[0021] 圖2為實施例2中釀酒酵母（CICC 1511)發酵過程曲線；其中不同曲線表征的發 酵過程參數同圖1 ;
[0022] 圖3為實施例3中釀酒酵母（CICC 1511)發酵過程曲線；其中不同曲線表征的發 酵過程參數同圖1 ;
[0023] 圖4為實施例4中釀酒酵母（CICC 1511)高密度發酵的發酵過程曲線；其中不同 曲線表征的發酵過程參數同圖1 ;
[0024] 圖5為實施例5中釀酒酵母（CICC 32280)高密度發酵的發酵過程曲線；其中不同 曲線表征的發酵過程參數同圖1。
【具體實施方式】
[0025] 斜面保藏培養基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,瓊脂25。
[0026] 種子培養基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10。
[0027] 發酵培養基（g/L):工業葡萄糖65,尿素1. 8,工業玉米粉10, KH2PO4 10, MgSO4 4， ZnSO4 10mg/L, FeSO4 12mg/L, MnSO4 2mg/L〇
[0028] 補料培養基：500g/L葡萄糖溶液。
[0029] 實施例1 :
[0030] 取釀酒酵母CICC 1511，按以下方法制備種子液：
[0031] (1)種子培養基配置完成，分裝于500mL搖瓶中，115°C滅菌20min，冷卻至室溫。
[0032] (2)取一環保存于斜面培養基中的釀酒酵母菌，接種于種子培養基中，培養溫度為 30°C，裝液量50mL/500mL，搖床轉速200rpm，培養24h。
[0033] (3) 7L罐中使用4種不同的發酵培養基和補料培養基，培養基成分如下：