一種產(chǎn)曲酸真菌菌株及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物真菌分離培養(yǎng)，具體涉及產(chǎn)曲酸菌株的分離培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 曲酸是由米曲霉等微生物產(chǎn)生的一種酸性代謝產(chǎn)物，能溶于水、乙醇或醋酸酯 等。能產(chǎn)生曲酸的微生物多數(shù)為真菌，如米曲霉、米黃曲霉、黃曲霉、亮白曲霉、棒曲霉、巨 大曲霉、煙曲霉、溜曲霉、溫特曲霉和灰綠曲霉。某些細(xì)菌如玫瑰葡糖桿菌、蠟狀葡糖桿菌 和若干假單胞菌也可利用糖類生成曲酸 Arbakariya B. Ariff et al. , Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production. Biotechnology and Molecular Biology Reviews Vol. 5(2), pp. 24-37, 2010)〇
[0003] 持續(xù)開(kāi)展高產(chǎn)曲酸微生物菌株分離及培養(yǎng)使其具有工業(yè)用途很有必要。這是因 為，曲酸用途廣泛，集抗菌、防腐、保鮮、護(hù)色發(fā)色、抗氧化等作用于一身。作為食品添加劑， 其食品防腐劑的性能比山梨酸更理想；也可作為生鮮蔬菜、水果、海產(chǎn)品等的保鮮，而在護(hù) 色發(fā)色上可部分取代亞硝酸鈉，并能抑制亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為致癌的亞硝胺。曲酸作為酪氨酸 酶抑制劑，搶先與酪氨酸酶中的銅離子螯合，使銅離子失去作用，抑制多巴色素的合成。曲 酸能抑制5,6-二羥基吲哚，即DHI的聚合，抑制DHICA氧化酶的活性。
[0004] 添加曲酸的化妝品有護(hù)膚、潤(rùn)膚、美白、光亮、防曬、祛斑的功能。盡管曲酸在化 妝品中的生物安全性在一段時(shí)間內(nèi)引起較多爭(zhēng)論，但最新證據(jù)表明：曲酸在化妝品中的 添 tW;獻(xiàn)衝安全飽〈Christina L. Burnett, Wilma F. Bergfeld, F. Alan Andersen， et al. Final report of the safety assessment of kojic acid as used in cosmetics. International Journal of 29 (Supplement 4)，244S-273S， 2010)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著更多安全性評(píng)價(jià)證據(jù)的支持，曲酸在日化領(lǐng)域的應(yīng)用還具有很大延 伸空間。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明旨在通過(guò)分離和篩選而提供一種曲酸合成微生物一集峰曲霉 FECH-998菌株，并以該菌株為產(chǎn)曲酸的候選菌株，提供發(fā)酵條件及 菌株育種優(yōu)化方法。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)發(fā)明目的。
[0007] (-）一種產(chǎn)曲酸化合物的真菌菌株 該菌株為集峰曲霉 λολζΛλ?) FECH-998,保藏編號(hào)為CGMCC No :10987,所 述菌株FECH-998所產(chǎn)的鐵螯合化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式如附圖3所示。 (二）制備產(chǎn)曲酸化合物的真菌菌株的方法 包括以下步驟： (1)制備孢子懸液及液體培養(yǎng)液 將菌株FECH-998接種于去鐵查氏瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂斜面上，斜面試管規(guī)格為 015X150 mm，該瓊脂培養(yǎng)基體積5 mL，28°C培養(yǎng)4~7 d，待菌絲體形成大量孢子后，向斜 面加入5 mL無(wú)菌去離子水，滅菌竹簽輕刮洗菌苔制成孢子懸液； 將菌株FECH-998孢子懸液分別接種到裝有去鐵查氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3支試管中，試管規(guī) 格為015 X 150 mm，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積5 mL，28°C培養(yǎng)7 d，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大量菌絲 生長(zhǎng)及孢子時(shí)以其作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液； 所述的去鐵查氏瓊脂培養(yǎng)基（g/L) =NaNO3 2.0 g、K2HP04 1.0 g、KCl 0.5 g、MgS04 0.5 g、鹿糖30. 0 g、瓊脂20. 0 g、去離子水I L、pH自然，配好后121°C滅菌20 min ; 所述的去鐵查氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基與去鐵查氏瓊脂培養(yǎng)基的成分區(qū)別是：去鐵的查氏基礎(chǔ)培 養(yǎng)基不加入瓊脂，其余成分相同； (2) 篩選 用96孔板每孔中加入20微升CAS染液和等體積的步驟（1)的液體培養(yǎng)液，充分混合， 以顏色反應(yīng)為紅色或橘紅色或棕黃色或紫色的真菌作為候選菌株，將其按步驟1方法制備 孢子懸液，接種到IOOmL去鐵查氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28°C、180rpm培養(yǎng)5d ; 用96孔板每孔中加入40微升CAS染液和等體積的候選菌株培養(yǎng)液，充分混合，記錄顏 色變化時(shí)間，將反應(yīng)用時(shí)最短、反應(yīng)顏色變化差異大的菌株FECH-998作為優(yōu)選菌株； (3) 制備發(fā)酵粗提取物 取步驟（2)10支FECH-998菌株制備孢子懸液接種于10X200 mL滅菌液體去鐵查氏培 養(yǎng)基中，28°C，180 rpm培養(yǎng)5 d，待培養(yǎng)液內(nèi)有大量菌絲球生長(zhǎng)停止培養(yǎng)，以該培養(yǎng)液為種 子液； (4) 取步驟（3)種子液，按10%接種比例用無(wú)菌吸管將其平均接種到50瓶各裝有200 mL滅菌去鐵查氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，28°C~32°C，180 rpm培養(yǎng)3 d~8 d，待 培養(yǎng)液內(nèi)有大量菌絲球生長(zhǎng)時(shí)按2%比例向三角瓶?jī)?nèi)投放粒徑60~16目的大孔吸附樹(shù)脂， 28°C~32°C，180 rpm原位吸附24 h后停止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，過(guò)濾；菌渣和樹(shù)脂用甲醇提 取，濾液用乙酸乙酯萃取，得到甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物； (5) 將甲醇提取物減壓濃縮、干燥，得到夾雜大量白色細(xì)針狀結(jié)晶的黃色油狀物23. 8 g;將乙酸乙酯萃取物減壓濃縮、干燥，得到夾雜大量白色細(xì)針狀結(jié)晶的棕淺棕色固型物 11. I g，合并二者，作為粗提物。
[0008] 進(jìn)一步，所述的制備方法是：所述步驟（4)是以高糖培養(yǎng)基取 代去鐵查氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該高糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)為：蔗糖100.0 g、酵母膏6.0 g、 NaNO3 2. 0 g、K2HPO4 I. 0 g、KCl 0· 5 g、MgSO4 0· 5 g、去離子水 I L、pH 自然；配好后 121 °C 滅菌20 min ;所述高糖培養(yǎng)基的發(fā)酵液中曲酸含量為15. 65g/L，曲酸轉(zhuǎn)化比例為0. 157g曲 酸/g蔗糖。
[0009] 進(jìn)一步，所述的制備方法是分離純化步驟（5)粗提物，包括： (1) 正相硅膠柱層析梯度洗脫，該層析系統(tǒng)梯度為：氯仿、氯仿：甲醇=9:1及甲醇；CAS 液體顯色法追蹤各段洗脫液含有鐵螯合活性成分的餾分； (2) 餾分減壓蒸干活性成分，用石油醚洗滌除去油狀物，甲醇溶解，室溫下反復(fù)結(jié)晶和 重結(jié)晶獲得白色細(xì)針狀化合物，該化合物具有很強(qiáng)的鐵螯合活性。
[0010] 本發(fā)明具有以下實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步： 本發(fā)明以分離自堿性限鐵環(huán)境土壤樣品的100株真菌菌株為材料，以CAS顯色原理為 指導(dǎo)篩選不同層次的篩選模型，獲得模型中鐵螯合物質(zhì)活性強(qiáng)的集峰曲霉FECH-998微生 物菌株。經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定，F(xiàn)ECH-998被鑒定為集峰曲霉floaziiAs)菌株。 該菌株于2015年6月17日在"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"（地址： 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101)進(jìn)行了有效保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No: 10987。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步以集峰曲霉FECH-998為出發(fā)菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，劃段初分粗提取 物，并通過(guò)考察菌株產(chǎn)曲酸能力以高糖培養(yǎng)基為種子液的液體培養(yǎng)基使發(fā)酵液中曲酸含量 提高到15. 65g/L，曲酸轉(zhuǎn)化比例為0. 157g曲酸/g蔗糖。
[0012] 除此之外，本發(fā)明還提供了活性部位純化精制、指認(rèn)活性物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)等獲得目 標(biāo)化合物的步驟。
[0013] 本發(fā)明表明：菌株FECH-998野生菌株合成曲酸營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)孢量 大、后期菌株育種空間大，具有作為產(chǎn)曲酸高產(chǎn)菌株的良好潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖 1 為菌株 FECH-998 與標(biāo)準(zhǔn)菌株 NRRL13137 ITS 序列的系 統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。