一種預測他汀類藥物療效和安全性的基因突變檢測芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種預測他汀類藥物療效和安全性相關基 因突變檢測芯片。
【背景技術】
[0002] 他汀類藥物是一種羥甲戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，廣泛用于心血管 疾病的降脂治療。具有調脂作用強、耐受性好等優點。但是，他汀類藥物無論是在控制血脂 水平還是不良反應方面，不同個體之間存在著顯著差異。當他汀類藥物與貝特類降脂藥合 用時可造成個別患者的橫紋肌溶解而導致死亡。目前，臨床上對他汀類藥效和安全性的評 估主要還是依靠經驗，即在患者服藥后再進行評估。因此，找出這些差異以及改變目前傳統 的用藥方案，不但可以安全有效的用藥，而且具有極大的經濟學價值。
[0003] 生物芯片是通過縮微技術，根據分子間特異性相互作用的原理，將生命科學領域 中不連續的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，以實現對細 胞、蛋白質、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。
[0004] 目前用于突變檢測的大多是序列特異性探針雜交法（SSOP)基因芯片技術，該種 技術利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特點，對發生突變的眾多基因設計序 列特異性的寡核苷酸探針，將這些探針固定于同一張基片上，將待測的包含突變位點的基 因片段進行體外擴增后與芯片雜交，根據雜交的信號判斷突變位點的基因型。這種方法的 基本原理是與基因特定序列互補的一段序列特異性寡核苷酸探針對基因序列的特異性識 另Ij。當探針的序列與基因序列完全匹配時所形成的雜交體熱穩定性高于含有錯配堿基的雜 交體，據此通過控制雜交溫度和其他雜交條件可以使完全匹配的雜交體與含有錯配堿基的 雜交體區分開來，從而達到基因分型的目的。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在為服用他汀類藥物的患者中進行療效和安全性個體化差異的預測。
[0006] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0007] -種預測他汀類藥物療效和安全性相關的基因突變檢測芯片，包括固相基片和 點載在固相基片上的基因探針陣列；所述基因探針是與他汀類藥物療效和安全性相關 的寡核苷酸序列；所述藥物療效和安全相關的基因突變位點是CYP3A4*lG(rs2242480)、 CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3APl*3(rs2177180)和 SLC01Bl*5(rs4149056)。所述 CYP3A4、 CYP3A5、CYP3AP1 和 SLC01B1 的序列如 SEQ ID NO. 1-4 所示。
[0008] 其中，所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針，基因探針長度為 18-22bp,所述基因探針包括：
[0009] CYP3A4*lGrs2242480 野生型探針 5 ' -tggtacatggagaaggagg-3 '
[0010] (SEQ ID NO. 5)
[0011] CYP3A4*lGrs2242480 突變型探針 5 ' -cctccttctccatgtatcatcc-3 '
[0012] (SEQ ID NO. 6)
[0013] CYP3A5*3Crs776746 野生型探針 5 ' -agtatctcttccctgtttg-3 '
[0014] (SEQ ID NO. 7)
[0015] CYP3A5^3Crs7767A6 突變型探針 5 ' -ccaaacagggaagagatattga-3 '
[0016] (SEQ ID NO. 8)
[0017] CYP3APl*3rs2177180 野生型探針 5 ' -cagccccgcctccttctc-3 '
[0018] (SEQID NO. 9)
[0019] CYP3APl*3rs2177180 突變型探針 5 ' -ctggagaaggaggtggggctgc-3 '
[0020] (SEQ ID NO. 10)
[0021] SLC01Bl*5rs4149056 野生型探針 5 ' -gcatattacccatgaacac-3'
[0022] (SEQ ID NO. 11)
[0023] SLC01Bl*5rs4149056 突變型探針 5 ' -gcgttcatgggtaatatgc-3 '
[0024] (SEQ ID NO. 12)
[0025] 所述基因探針還包括：
[0026] 陽性參照探針：5' -atatgcttcgtggaatagggga-3' （SEQ ID NO. 13)
[0027] 陰性參照探針：5' -gagcatgcctttattgtaaccc-3' （SEQ ID NO. 14)
[0028] 所述固相基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龍膜等固相介質中的一種或他們的 任意組合。
[0029] 為提1?探針與基片結合的效率和檢測靈敏度，所述探針和基片可作進一步修飾和 包被。如其基片表面處理方式可為多聚賴氨酸包被、瓊脂糖包被、氨基或醛基化修飾。
[0030] 本發明的芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針，基因探針 含有預測他汀類藥物療效和安全性相關基因突變位點的互補寡核苷酸序列。目前的研究結 果顯示這些突變位點在人群中的發生頻率較高，且對他汀類藥物反應有明顯影響。此外，出 于芯片質量控制的要求，芯片上基因探針可設置陽性和陰性參照探針。每個位點設計野生 型和突變型兩種探針，其長度為18-22bp。
[0031] 本發明的芯片制造方法是：根據所需檢測的基因位點附近的堿基序列，每個突變 位點設計野生型和突變型兩種探針，并設置陽性和陰性參照探針，設計長度范圍18_22bp， 使用DNA序列合成儀合成探針，用點樣裝置將探針按一定的間距點在基片上，點樣面積可 根據探針數量、探針間距、點的大小等因素進行調整，點樣后將芯片按探針與基片結合方式 的不同，采取適當的方法進行固化。然后立即使用或貯存于4°C備用。
[0032] 本發明芯片的使用方法
[0033] (1)采樣
[0034] 從病人身上采血Iml ;
[0035] (2)樣本處理
[0036] 使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA ;
[0037] 以下涉及到熒光標記引物及其產物的操作步驟均在避光條件下（有紅燈的暗室 內）進行；
[0038] (3) PCR反應擴增
[0039] 使用基因突變位點特異性引物通過PCR反應對DNA標本擴增，使用熒光物質或同 位素對引物進行標記；
[0040] (4)雜交
[0041] 取PCR產物混合液，加陽性參照溶液及預熱的雜交液，混勻，變性3min后置冰上， 全部轉移到芯片的點樣區域（對照點樣矩陣定位芯片），加蓋玻片（注意不要有氣泡）；雜 交艙里加幾滴水，以保持濕度；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進恒溫箱或水浴保 溫Ih ;
[0042] (5)洗片
[0043] 打開雜交艙，取出芯片，用洗脫液沖掉蓋玻片，然后把芯片放入洗脫液中，室溫 (25°C ±10°C )放置5min，用滅菌雙蒸水沖洗二遍，室溫下干燥；
[0044] (6)讀片
[0045] 推薦使用ScanArray4000掃描儀在60-85掃描強度下掃描；
[0046] (7)結果分析
[0047] 采用人工判讀或使用配套軟件分析。根據基因型分析結果判斷他汀類藥物的療效 和安全性。
[0048] 利用本發明的芯片，只需病人Iml血液，便能夠再3_4h內迅速得到結果，并配合專 用軟件，向臨床醫生提供明確的建議。采用這一新的檢測芯片，醫生可以在患者服藥前對用 藥方案進行調整，大大減少了病人不必要的痛苦與經濟負擔。并且，采用基因芯片技術，可 以同時檢測多個變異位點，一次判斷患者用藥的療效和安全性，檢測結果可以終生指導其 治療。
[0049] 本發明采用生物芯片技術檢測與他汀類藥物療效和安全性相關的基因突變位點， 提前預測藥物的療效和毒性，輔助臨床醫師制定個體化用藥方案，使患者治療利益最大化。
【附圖說明】
[0050] 圖1為本發明所述芯片整體結構示意圖；
[0051] 圖2為本發明所述基因探針陣列示意圖。
[0052] 圖注如下：1.承載基片2點樣區3基因探針陣列4貼標簽處
【具體實施方式】
[0053] 以下對本發明制造的基因突變芯片做進一步的詳細描述。
[0054] 通過臨床觀察以及文獻挖掘，選出和他汀類藥物療效和安全性密切相關的 4個基因突變位點制作基因突變檢測芯片。這4個位點是CYP3A4*1G (rs2242480)、 CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3AP1*3(rs2177180)和 SLC01B1*5(rs4149056)。
[0055] 基片處理：基片采用玻璃介質，其表面處理方式采用氨基化修飾。具體步驟如下：
[0056] (1)在2mol/lNa0H-70%乙醇溶液中清洗玻片2h后，用蒸餾水沖洗5遍，IKTC烤 干并冷卻至室溫；
[0057] ⑵將玻片置于1%的3-氨丙基三甲基硅烷-95%丙酮溶液中浸泡2min ;
[0058] (3)取出后用丙酮沖洗10次，每次5min ;
[0059] (4) IlCTC干燥 45min ;
[0060] (5)在lg/L的1,4-苯二異硫氰酸鹽溶液中處理2h ;
[0061] (6)用甲醇清洗5min，丙酮沖洗5min，室溫干燥。
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