胰腺癌相關多肽dap44單克隆抗體的制備及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于抗腫瘤技術領域，涉及一種胰腺癌相關多肽DAP44,及由多肽抗原免疫 實驗動物制備的雜交瘤細胞株和雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
【背景技術】
[0002] 胰腺癌是一種兇險的消化道惡性腫瘤，近年來其發病率成不斷上升趨勢。由于胰 腺解剖位置隱蔽，胰腺癌早期一般缺少典型的臨床癥狀，大多數胰腺癌患者發現時已處于 進展期，腫瘤已向周圍臟器、淋巴和血管侵潤或轉移。生存預后差，中位生存時間僅為3-5 個月，其5年生存率小于5 %。盡管外科手術是胰腺癌治療的唯一有效手段，但目前僅有不 足20%的病人可以達到一個滿意的手術切除和根治效果。研究表明，腫瘤分期是一個影響 胰腺癌預后的重要獨立影響因素，分期越早的病人其預后越好；癌腫小于Icm或更小時確 診，切除率可達90%，且術后生存率明顯改善。因此，胰腺癌的早期診斷是患者存活率提高 的關鍵。
[0003] 目前對于胰腺癌的診斷主要依賴于影像學方法如CT或MRI等，但對于胰腺癌的 早期診斷敏感性不高，難以發現較小的胰腺腫瘤（直徑< 1.5cm)。臨床上也多應用腫瘤標 志物來輔助診斷胰腺癌，目前研究較多的血清標志物有血清癌胚抗原（CEA)、胰腺癌胚抗原 (POA)、胰腺相關抗原（PCAA)、胰腺特異性抗原（PaA)和糖抗原（CA19-9)等。其中最常用的 〇八19-9，對胰腺癌的較高的特異性（82%~90%)和敏感性（79%~81%)。但0419-9作 為輔助診斷指標，存在一定的局限性，如在胰腺炎、肝硬化等良性疾病和消化道其它惡性腫 瘤中出現假陽性；在Lewis a陰性基因型患者中的出現假陰性。因此，尋找一種新的高敏感 性、特異性胰腺癌相關腫瘤標志物對胰腺癌的診斷具有重大臨床意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一在于提供一種可用于胰腺癌檢測的腫瘤標志物。通過體積排阻 高效色譜和質譜檢測篩選了一段長度為44個氨基酸的多肽序列，該多肽在胰腺癌中特異 性高表達，經生物學信息分析發現，該多肽與精神分裂癥相關蛋白DNTBPl高度同源，將該 多肽命名為DTNBPlAssociated P印tide(DAP44)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0005] 本發明的另一個目的是提供了一種DAP44的抗原表位，其序列如SEQ ID NO :2所 不。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供了一種能特異性識別DAP44蛋白的單克隆抗體，其 制備方法為：
[0007] (1)利用上述DAP44抗原表位肽免疫動物；
[0008] (2)取經免疫的動物脾細胞與骨髓瘤細胞融合，得到可穩定分泌抗DAP44抗原表 位多肽的雜交瘤細胞；
[0009] (3)雜交瘤細胞腹腔接種BALB/Ac小鼠，制備腹水。即為抗DAP44蛋白表位多肽的 單克隆抗體。
[0010] 本發明的另一個目的在于提供了一種DAP44單克隆抗體，由保藏號為CCTCC C201564(N〇. 2D1C11)的雜交瘤細胞系所產生。
[0011] 本發明的另一個目的在于提供了一種DAP44單克隆抗體，其由保藏號為CCTCC C201565(N〇.1E8H3)的雜交瘤細胞系所產生。
[0012] 本發明提供由上述雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體，經抗體配對篩選，所得抗 體具有高度的親和性和特異性，能夠與DAP44結合，從而對胰腺癌進行檢測。
[0013] 本發明所述單克隆抗體可以是，例如單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述 抗體的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何多肽。
[0014] 本發明產生抗體間接ELISA效價不低于1 :512000。
[0015] 本發明的單克隆抗體，具有良好的穩定性，對DAP44具有很好的特異性識別能力。
[0016] 本發明的單克隆抗體及DAP44多肽表位用于胰腺癌的診斷。
【附圖說明】
[0017] 圖Ia是胰腺癌患者術前血清質譜圖。
[0018] 圖Ib是胰腺癌患者術后血清質譜圖。
[0019] 圖2是酶切后肽段的質譜圖。
[0020] 圖3-1是No. 2D1C11單克隆抗體的免疫組化應用。
[0021] 圖3-2是No. 1E8H3單克隆抗體的免疫組化應用。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1 DAP44蛋白的篩選與測序
[0023] 收集臨床50例胰腺癌患者術前和術后第5天血清蛋白樣本，預處理去除白蛋白等 大分子，蛋白濃縮定量。準備好刀豆蛋白A填充的親和層析色譜柱，將樣品直接裝載在親和 色譜柱上（分離色譜），檢測波長280nm。由于缺少糖基化位點，血清中的大多數蛋白質不 與親和色譜柱的刀豆蛋白A發生相互作用，只有少數蛋白質區域表現出對刀豆蛋白A的強 烈親和性，親和柱上所保留的即為N端糖基化的糖蛋白。通過體積排阻色譜高效分離和收 集蛋白樣本，利用MALDI-TOF - MS質譜技術分析比較胰腺癌患者術前和術后第五天的血 清糖蛋白質譜結果，發現在所有檢測到的質量/電荷（M/Z)峰值中，胰腺癌患者的術前血清 中有一個明顯的高強度峰值，而在術后峰值較低。隨后我們對50例患者術前和術后血清進 行了評估，其中在42例患者血清中發現了同樣的峰值變化，陽性率為84 %，表明該峰可能 對應一個潛在的胰腺癌腫瘤標志物（圖1)。以PNGase F酶裂解此峰的碳水化合物基團，通 過質譜分析發現，此峰值具有1086. 8的質荷比（圖2)。經過肽段測序和生物學信息分析， 發現其為一段含有44個氨基酸的多肽片段，氨基酸序列SEQ ID NO :1。該多肽的前36個 氣基酸序列與精神分裂癥相關蛋白DTNBPl的N端序列完全一致，提不該多妝可能與DTNBPl 高度同源，命名為 DTNBPlAssociated Peptide (DAP44)。
[0024] 實施例2小鼠單克隆抗體的制備與篩選
[0025] 小鼠免疫
[0026] 利用多肽固相化學合成法合成DAP44抗原表位肽，序列如SEQ ID NO :2所示，末端 進行KLH偶聯。取8周齡健康BALB/Ac小鼠，將適量合成的KLH偶聯半抗原與弗氏完全佐 劑1:1混合乳化，行背部皮下多點免疫。首次免疫后2周，將DAP44蛋白與弗氏不完全佐劑 混合，再次免疫小鼠，方法同前。以后每隔3周，進行第三、四次強化免疫。第四次免疫3天 后，小鼠眼靜脈取血，選擇血清ELISA效價較高的小鼠做細胞融合。
[0027] 細胞融合、雜交瘤細胞株的建立
[0028] 取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0(脾細胞：Sp2/0 = 5:1)在PEG4000作用下融 合。將融合后的細胞轉移至預先接種飼養細胞的9