一種抗凝血黑莓籽有效成分及其提取分離方法、應用
【專利說明】
[0001]
技術領域 本發明屬于植物提取技術領域，具體涉及一種抗凝血黑莓籽有效成分及其提取分離方 法、應用。
【背景技術】
[0002] 黑莓jftz/wsspp. Blackberry為薔薇科懸鉤子屬聚合果類植物，未作藥用，是世界上新 興的4種小果類果樹之一。原產北美，其果實酸甜可口，具有很高的營養價值和藥用價值， 除鮮食外還大部分制成速凍果、果汁、果酒和果醬等食品。文獻檢索發現對黑莓研究主要集 中在果實揮發油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓葉、種子中黃酮、花色苷及維生素￡含量分析 方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工產品的副產物，含有約27. 14%的功能性油脂， 其中不飽和脂肪酸總量高達93. 55%，此外還有人體必需的氨基酸，在對抗動脈粥樣硬化、抗 糖尿病、免疫調節、促進生長和智力發育等方面具有重要的作用。
[0004] 凝血的實質是呈水溶性的纖維蛋白原轉變為水中不溶解的固態纖維蛋白的過程， 是在內源性或(和）外源性凝血途徑下產生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下產生凝血 酶，最后在凝血酶的作用下使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途 徑中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映內源性凝血系統狀況，與VIII、X、XI、 XII等內源性凝血因子活性有關；TT值是主要反映纖維蛋白原轉變為纖維蛋白程度的重要 指標；FIB主要反映纖維蛋白原的含量。
[0005] 血栓形成是許多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深靜脈血栓等的基本病理過程，它 嚴重地危害著人類的健康，它的形成與血小板的聚集、粘附、內源性和外源性凝血系統以及 纖維蛋白的形成密切相關。根據世界衛生組織的調查報告，由于動脈粥樣硬化導致的血栓 疾病引起的死亡已經排到了第一位。動脈血栓是由于動脈粥樣硬化，斑塊不穩定發生了斑 塊的破裂，使血液里的血小板發生聚集，激活了體內的凝血系統，最后導致血栓形成。一旦 堵塞以后就會發生組織的缺血和壞死，產生嚴重的后果。在動脈血栓性疾病的急性或特殊 狀態下，需要輔助使用抗凝血藥物，才能達到更好的抗血栓效果。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種抗凝血黑莓籽有效成分，同時提供一種抗凝血黑莓籽有效 成分的提取分離方法和應用。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案： 一種抗凝血黑莓籽有效成分的提取分離方法，包括以下步驟：1)以黑莓籽為原料，黑莓 籽破碎后，用石油醚浸提(浸提3-4次，每次3d)，石油醚浸提液合并揮干石油醚后，加入70 %乙醇浸提(浸提3次，每次3d)，乙醇浸提液合并、過濾、濃縮得乙醇總浸膏，依次用溶劑石 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； 2) 乙酸乙酯部位進行200~300目硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，比例為 100:0~1:1，以TLC薄層色譜檢測合并，得到6個組分，按照所得組分極性由小到大依次標記 為組分1-6 (極性判斷時所用體系為石油醚-乙酸乙酯)，其中組分5再經反復硅膠H柱色 譜、S印hadex LH-20柱色譜得到化合物1; 3) 正丁醇部位加入70 %乙醇溶解后，D-101大孔樹脂吸附上樣，靜置過夜，后依次用 水、20 %乙醇、40 %乙醇、60 %乙醇、80 %乙醇和無水乙醇梯度洗脫，每種洗脫液洗脫5個 柱體積，每次2000 mL，回收洗脫液后，得到相應洗脫部分； 80%乙醇洗脫部分經硅膠H柱色譜，得到2個組分，按照所得組分極性由小到大依次標 記為組分1-2 (極性判斷時所用體系為二氯甲烷-甲醇)，組分1經Sephadex LH-20凝膠 柱色譜，得到化合物2,組分2經Sephadex LH-20凝膠柱色譜與反復硅膠H柱色譜，得到化 合物3; 60 %乙醇洗脫部分先進行200~300目硅膠柱色譜，后經硅膠H柱色譜，TLC薄層色譜 檢測合并，得到2個組分，按照所得組分極性由小到大依次標記為組分1-2 (極性判斷時所 用體系為二氯甲烷-甲醇)，組分1經反復硅膠H柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜，得 到化合物4;組分2經反復S印hadex LH-20凝膠柱色譜、硅膠H柱色譜，后所得樣品經反相 液相制備色譜得到化合物5; 40 %乙醇洗脫部分先進行200~300目硅膠柱色譜，后經反復硅膠H柱色譜、S^hadex LH-20凝膠柱色譜，得到化合物6; 化合物1、2、3、4、5、6即為抗凝血黑莓籽有效成分。
[0008] 按照以上提取分離方法得到的抗凝血黑莓籽有效成分。
[0009] 抗凝血黑莓籽有效成分在制備抗凝血藥物方面的應用。
[0010] 化合物1、2、3、4、5、6依次是1〇'，2〇'，3々，19〇'-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸（化 合物1)、委陵菜酸（化合物2)、9〇)_十八烯酸酰胺（化合物3)、甜葉苷Rl (化合物4)、 坡模酸-28-f P-D-吡喃葡萄糖酯（化合物5)、3, 5, 7, 2'，5' -五羥基黃烷（化合物6)，其 結構分別如下：
[0011] 本發明采用特殊的方法從黑莓籽的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中分離得到6個 化合物，并對其體外抗凝血效果的考察，結果表明，化合物1~6均具有良好的抗凝血效果， 且化合物4~6的抗凝血效果比燈盞花素好，可見，它們可以單獨或組合用于抗凝血劑。
【附圖說明】
[0012] 圖1為效果實驗時的凝血機制圖。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1 黑莓籽購于河南省封丘縣黑莓種植基地，為薔薇科懸鉤子屬植物黑莓沿/Ai/sspp. Blackberry 軒。
[0014] 本文中的乙醇濃度均為體積濃度。
[0015] 活性化合物的提取分離方法： (1) 黑莓籽破碎后，先用石油醚浸提4次，每次3 d，揮干石油醚后，加入70 %乙醇浸提 3次，每次3 d，浸提液合并、過濾、濃縮得乙醇總浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃 取，回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； (2) 乙酸乙酯部位進行200~300目硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫（體積比例 100:0~1:1)，以TLC薄層色譜檢測合并，得到6個組分，按照所得組分極性由小到大依次標 記為組分1-6 (極性判斷時所用體系為石油醚-乙酸乙酯)，其中組分5再經反復硅膠H柱 色譜、S印hadex LH-20柱色譜等得到化合物1; (3) 正丁醇部位加入70 %乙醇溶解后，D-101大孔樹脂吸附上樣，靜置過夜，后依次用 水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇梯度洗脫，每種洗脫液洗脫5個柱體 積，每次2000 mL，回收洗脫液后，得到相應洗脫部分； 80 %乙醇洗脫部分經硅膠H柱色譜，得到2個組分，按照所得組分極性由小到大依次標 記為組分1-2 (極性判斷時所用體系為二氯甲烷-甲醇)，組分1經Sephadex LH-20凝膠 柱色譜，得到化合物2;組分2再經Sephadex LH-20凝膠柱色譜與反復硅膠H柱色譜，得到 化合物3; 60 %乙醇洗脫部分先進行200~300目硅膠柱色譜，后經硅膠H柱色譜，TLC薄層色譜 檢測合并，得到2個組分，按照所得組分極性由小到大依次標記為組分1-2 (極性判斷時所 用體系為二氯甲烷-甲醇)，組分1經反復硅膠H柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜，得 到化合物4;組分2經反復S印hadex LH-20凝膠柱色譜、硅膠H柱色譜，后所得樣品進行吉 爾森制備液相得到化合物5; 40 %乙醇洗脫部分先進行200~300目硅膠柱色譜，后經反復硅膠H柱色譜、S^hadex LH-20凝膠柱色譜，得到化合物6。
[0016] 化合物 1、2、3、4、5、6依次是1〇'，2〇'，3々，19〇'-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸（1)、 委陵菜酸（2)、9〇)_十八烯酸酰胺（3)、甜葉苷Rl (4)、坡模酸-28-f P-D-吡喃葡萄糖 酯（5)、3, 5, 7, 2'，5' -五羥基黃烷（6)，運用多種譜學技術鑒定結構如下： 1 σ，2 σ，3々，19 σ-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸（1):白色粉末，C30H48O6, EI_MS?/z: 504 [Μ] +。1H-NMR (CD3OD, 400 MHZ) J: 0· 85 (3H，s，23-CH3)，0· 93 (3H，s，24-CH3)， 0.97 (3H, d,方4.0 HZ, 30-CH3), 1.02 (3H, s, 25-CH3), 1.06 (3H, s, 26-CH3), 1.24 (3H, s, 29-CH3), 1.40 (3H, s, 27-CH3). 13C-NMR (CD3OD, 100 MHZ) 73.6 (C-l), 80.7 (C-2), 81.3 (C-3), 39.0 (C-4), 55.0 (C-5), 17.8 (C-6), 34.2 (C-7), 44.4 (C-8), 49.6 (C-9), 38.9 (C-10), 27.1 (C-Il), 130.7 (C-12), 138.9 (C-13), 42.6 (C-14), 30.7 (C-15), 28.3 (C-16), 49.6 (C-17), 55.0 (C-18), 73.6 (C-19), 43.1 (C-20), 27.1 (C-21), 38.9 (C-22), 29.7 (C-23), 22.4 (C-24), 12.9 (C-25), 16.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.4 (C-28), 19.4 (C-29), 27.3 (C-30)。
[0017] 委陵菜酸（2):白色粉末，C30H48O5,EI-MSa/z: 488[M] +。1H-NMR (CD3OD, 400 MHZ) δ： 0.79 (3Η, s, CH3-29), 0.80 (3Η, s), 1.01 (3Η, s), 1.01 (3Η, s), 1.18 (3Η, s), 1.33 (3Η, s), 0.93 (3Η, d, J=^ HZ, Η-30), 2.92 (1Η, d, J=12 ΗΖ, Η-3σ), 3.62 (1Η, d, J=12 HZ, Η-2 ^ ), 2.5 (1Η, s, Η-18), 5.29 (1Η, s, Η-12). 13C-NMR (CD3OD, 100 MHZ) J: 48.1 (C-I)，69.6 (C-2), 84.6 (C-3), 41.2 (C-4), 56.8 (C-5), 19.8 (C-6)， 34.2 (C-7)， 40.6 (C-8)， 48.2 (C-9)， 39.3 (C-10)， 24.9 (C-Il)， 129.4 (C-12), 140.2 (C-13), 42.7 (C-14), 29.7 (C-15), 26.7 (C-16), 48.3 (C-17), 55.2 (C-18), 73.7 (C-19), 43.1 (C-20), 27.4 (C-21), 39.1 (C-22), 29.4 (C-23), 17.6 (C-24), 17.1 (C-25), 17.5 (C-26), 24.8 (C-27), 182.3 (C-28), 27.2 (C-29), 16.6 (C-30)〇
[0018] 9⑵-十八烯酸酰胺（3):白色粉末，C 1SH35N0, EI-MS餘281[Μ]+。 1H-NMR(O)Cl3-CD 3ODdOO MHZ) ^ ： 5. 30 (2Η, m, -CH=CH-), 2. 16 (2H, t, J=^ HZ, -COCH2), 1.98 (4H, m, 8，11-CH2), 1.57 (2H, t,方8HZ, 3-CH2), 1.27 (20H, s, 4 ~ 7, 12 ~17-CH2), 0· 85 (3H, t,方8 HZ, 18-CH3). 13C-NMR(CDC13-CD30D，400 MHZ) J: 179.11 (C-I)，36.5 (