慶大霉素半抗原及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 慶大霉素（Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細 菌，由于其具有廣譜抑菌和殺菌作用，被廣泛應用于獸醫臨床和動物飼料添加劑。但GM的 血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應用過程中易產生毒副作用，尤其大 劑量不規范使用，易導致動物性食品中GM殘留超標，對人體健康構成危害，造成腎毒性和 耳毒性。許多國家在動物生產中嚴禁使用GM或規定有嚴格的最高殘留限量（MRL)，我國農 業部235號公告規定，動物性食品中GM的MRL為100ng/g。
[0003] 目前慶大霉素殘留檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串 聯質譜法、高效毛細管電泳法和免疫學檢測法。儀器法檢測價格昂貴，不適合在基層推廣使 用和大量篩選。免疫學測定方法靈敏度較高，特異性強，使用方便。因此，大規模篩選檢測 以免疫學檢測方法更實際、更具有應用前景。酶聯免疫吸附法（ELISA)以其靈敏度高、特異 性好、操作簡便、成本低等優點適合于大量樣品的快速篩選。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應用。
[0005] 本發明提供的慶大霉素半抗原分子結構式如式I所示：
[0006]
[0007]
[0008] 本發明提供的慶大霉素半抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結晶得到對羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產物。
[0010] 本發明的另一個目的是上述慶大霉素半抗原在免疫檢測中的應用，具體包括由所 述慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯得到的慶大霉素抗原，及由所得慶大霉素抗原免疫動物 制備得到的慶大霉素抗體，所述抗體為慶大霉素單克隆抗體。
[0011] 其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、鼠血 清蛋白、兔血清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
[0012] 本發明還提供由上述慶大霉素半抗原或慶大霉素抗原在檢測慶大霉素或制備檢 測慶大霉素的產品中的應用，具體涉及制備的酶聯免疫檢測試劑盒在檢測動物源性食品中 慶大霉素殘留的應用。
[0013] 本發明提供的慶大霉素半抗原、慶大霉素抗原合成方法簡單，通過免疫動物產生 了針對慶大霉素的特異性抗體，抗體的效價、特異性都比較好；用所得的抗體制備酶聯免疫 檢測試劑盒，檢測成本低，使用方便，檢測方法準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于 動物源性食品中慶大霉素殘留的現場監控和大量樣本的篩查。本發明的慶大霉素半抗原在 慶大霉素的檢測中發揮重要作用。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :慶大霉素半抗原合成路線圖
[0015] 圖2 :慶大霉素半抗原核磁共振圖
[0016] 圖3 :慶大霉素 ELISA標準曲線
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明，而不用來限制本發明的范圍。
[0018] 下述實施例中所使用的實驗方法、材料、試劑等，如無特殊說明，均為常規方法和 常規材料。
[0019] 實施例1 :慶大霉素半抗原的合成和鑒定（合成路線如圖1)
[0020] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及I. 05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結晶得到對羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產物。
[0021] 上述慶大霉素半抗原分子結構式如式I所示：
[0022]
[0023] 取上述產物用核磁共振確定結構，如圖2所示，11. Oppm的羧基信號峰、7. 44ppm及 8. 09ppm的芳環信號峰，說明半抗原合成成功。
[0024] 實施例2 :慶大霉素抗原的制備
[0025] 將慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯得到慶大霉素抗原，分子結構式如式II所示：
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[0028] -、免疫原制備
[0029] 取14mg慶大霉素半抗原用ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，各取30mg碳化 二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應液A ;稱取牛血清白蛋白（BSA) 50mg，使之充分溶解在3. SmL PBS (pH7. 2)溶液中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h ;用 0.0 lmol/L PBS溶液在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝， 于-20°C保存備用。
[0030] 二、包被原制備
[0031] 將BSA換為卵清蛋白（OVA)按上述方法制備得到包被原。
[0032] 實施例3 :慶大霉素單克隆抗體的制備
[0033] 動物免疫：將實施例2中得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為 150 μ g/只，使其產生抗血清。
[0034] 細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1比例與SP2/0 骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽 性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0035] 細胞凍存和復蘇：將慶大霉素的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成細胞懸液，在 液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入 培養瓶內培養。
[0036] 單克隆抗體的生產與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5mL/只，7天后 腹腔注射慶大霉素的單克隆雜交瘤細胞株，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹 水純化，-20°C保存。該單克隆抗體特異性好，檢測靈敏度可達0. 1 μ g/L。
[0037] 單克隆抗體的特異性
[0038] 抗體特異性是指它同特異性抗原結合的能力與同該類抗原類似物結合能力的比 較，常用交叉反應率作為評價標準。交叉反應越小，抗體的特異性則越高。
[0039] 將慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素做系列稀釋，制作標準曲線，分析得到 IC50,然后桉下式計笪奪叉反應率，結果見表1。
[0043] 實施例4 :由慶大霉素單克隆抗體制備的酶聯免疫檢測試劑盒
[0044] 一、酶聯免疫檢測試劑盒的組成
[0045] (1)包被慶大霉素偶聯抗原的酶標板；
[0046] (2)酶標二抗或酶標二抗濃縮液；
[0047] (3)抗體工作液；
[0048] (4)標準品溶液：濃度分別為 0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 9 μ g/L、2. 7 μ g/L、 8. I μ g/L，高濃度標準品溶液濃度為lmg/L ;
[0049] (5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯苯胺溶液；
[0050] (6)終止液為2mol/L的硫酸溶液；
[0051] (7)濃縮洗滌液為含0· 5%~1. 0%的吐溫-20的0· 1~0· 2mol/L ρΗ7· 2~7. 4 的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；
[0052] (8)濃縮復溶液為ρΗ7· 2~7. 6,0· 05~0· lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為 重量體積百分比。
[0053] 本試劑盒的主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈 敏度高、精確度高、準確度高等特點。
[0054] 二、酶聯免疫檢測試劑盒檢測實際樣本的應用
[0055] (一）樣本前處理方法一
[0056] 1、組織（雞肉、雞肝）樣本前處理方法
[0057] 稱取2. 0g±0. 05g去除脂肪的組織樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 6mL0. lmol/L PBS溶液（稱取13. 4g十二水合磷酸氫二鈉、20.0 g氯化鈉、0· 32g氫氧化鈉、 0. 5g二水合磷酸二氫鉀、0. 5g氯化鉀加入500mL去離子水溶解混勻），混勻IOmin ;加入 60°C水浴環境中60min，取出冷卻至室溫并搖勻；3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離 心IOmin ;移取上清液與復溶工作液（用去離子水將2 X濃縮復溶液按1:1體積比進行稀釋 (1份2X濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶，復溶工作液在4°C (39. 2 °F )環境 可保存一個月）以1:9的體積比進行稀釋（50 μ L上清液+450 μ L復溶工作液），取50 μ L 用于分析。
[0058] 2、鮮牛奶樣本前處理方法
[0059] 取20 μ L鮮牛奶樣本至2mL聚苯乙烯離心管中，加入780 μ L復溶工作液，混勻，取 50 μ L用于分析。
[0060] 3、奶粉樣本前處理方法