L-氨基酸的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種使用了棒狀桿菌型細菌的L-氨基酸的制造方法。L-氨基酸作為 動物飼料用的添加物、調味料或飲食品的成分、或氨基酸輸液等在工業上很有用。
【背景技術】
[0002] L-氨基酸例如可通過使用了具有L-氨基酸生產能力的各種微生物的發酵法進 行工業生產。作為利用發酵法的L-氨基酸的制造方法，例如可以舉出：使用野生型微生物 (野生株）的方法、使用由野生株衍生的營養缺陷株的方法、使用由野生株衍生為各種藥劑 抗性突變株的代謝調節突變株的方法、使用具有營養缺陷株和代謝調節突變株兩者的性質 的菌株的方法。
[0003] 另外，近年來，利用重組DNA技術提高L-氨基酸生產能力的微生物被用于L-氨基 酸的制造。作為提高微生物的L-氨基酸生產能力的方法，例如可以舉出：增強編碼L-氨基 酸生物合成體系酶的基因的表達（專利文獻1、專利文獻2)、或增強碳源向L-氨基酸生物 合成體系的流入（專利文獻3)。
[0004] 大腸桿菌（Escherichiacoli)具有至少2種無機磷酸攝入體系（非專利文獻 1)。一方面為低親和性的無機磷酸鹽轉運蛋白（low-affinityinorganicphosphate transporter;Pit)體系，另一方面為高親和性的磷酸特異轉運蛋白（high-affinity phosphate-specifictransporter;Pst)體系。作為編碼Pit體系的基因，已知有pitA基 因及pitB基因。作為編碼Pst體系的基因，已知有pstSCAB基因，pstSCAB基因的產物形 成復合物，作為Pst體系發揮作用。然而，未知這些磷酸鹽轉運蛋白的活性和L-氨基酸生 產的關聯。
[0005] 現有技術文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1 :美國專利第5, 168, 056號說明書
[0008] 專利文獻2 :美國專利第5, 776, 736號說明書
[0009] 專利文獻3 :美國專利第5, 906, 925號說明書
[0010] 非專利文獻
[0011]非專利文獻 1 :R.M.Harrisetal.，JournalofBacteriology,Sept. 2001 ,p5008-5014
【發明內容】
[0012] 發明所要解決的課題
[0013] 本發明的課題在于，開發一種提高棒狀桿菌型細菌的L-氨基酸生產能力的新型 技術，提供一種有效的L-氨基酸的制造方法。
[0014] 用于解決課題的手段
[0015] 本發明人為了解決上述課題進行了潛心研究，結果發現，通過以磷酸鹽轉運蛋白 的活性增大的方式對棒狀桿菌型細菌進行修飾，可以提高棒狀桿菌型細菌的L-氨基酸生 產能力，完成了本發明。
[0016]SP，本發明可如下例示。
[0017] [1]一種L-氨基酸的制造方法，其包括在培養基中培養具有L-氨基酸生產能力的 棒狀桿菌型細菌及從該培養基中采集L-氨基酸，其特征在于，
[0018] 所述細菌以磷酸鹽轉運蛋白的活性增大的方式進行了修飾。
[0019] [2]如上述的方法，其中，通過使編碼磷酸鹽轉運蛋白的基因的表達上升，磷酸鹽 轉運蛋白的活性增大。
[0020] [3]如上述的方法，其中，所述基因為pitA基因。
[0021] [4]如上述的方法，其中，所述pitA基因為下述（a)或（b)中記載的DNA:
[0022] (a)具有序列號5或25所示的堿基序列的DNA;
[0023] (b)在嚴格的條件下可與由序列號5或25所示的堿基序列的互補序列或與可自所 述互補序列制備的探針雜交的DNA，且其中所述可雜交的DNA編碼具有磷酸鹽轉運蛋白活 性的蛋白質。
[0024] [5]如上述的方法，其中，所述pitA基因為編碼下述㈧或⑶中記載的蛋白質的 DNA：
[0025] (A)具有序列號6或26所示的氨基酸序列的蛋白質、
[0026] (B)具有在序列號6或26所示的氨基酸序列中含有1或者多個氨基酸殘基的取 代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的蛋白質，且其中所述蛋白質具有磷酸鹽轉運蛋白活 性。
[0027] [6]如上述的方法，其中，所述基因的表達通過提高該基因的拷貝數和/或修飾該 基因的表達調節序列來上升。
[0028] [7]如上述的方法，其中，通過在所述細菌中保持編碼磷酸鹽轉運蛋白的突變型 pitA基因，磷酸鹽轉運蛋白的活性增大，所述磷酸鹽轉運蛋白具有相當于序列號6的246位 的苯丙氨酸殘基的氨基酸殘基被取代為苯丙氨酸以外的氨基酸殘基的突變。
[0029] [8]如上述的方法，其特征在于，相當于序列號6的246位的苯丙氨酸殘基的氨基 酸殘基被取代為絲氨酸殘基。
[0030][9]-種L-氨基酸的制造方法，其包括在培養基中培養具有L-氨基酸生產能力的 棒狀桿菌型細菌及從該培養基中采集L-氨基酸，其特征在于，
[0031] 所述細菌保持有編碼磷酸鹽轉運蛋白的突變型pitA基因，所述磷酸鹽轉運蛋白 具有相當于序列號6的246位的苯丙氨酸殘基的氨基酸殘基被取代為苯丙氨酸以外的氨基 酸殘基的突變。
[0032] [10]如上述的方法，其特征在于，相當于序列號6的246位的苯丙氨酸殘基的氨基 酸殘基被取代為絲氨酸殘基。
[0033] [11]如上述的方法，其中所述細菌是棒狀桿菌屬（Corynebacterium)細菌。
[0034] [12]如上述的方法，其中，所述棒狀桿菌型細菌為谷氨酸棒狀桿菌。
[0035] [13]如上述的方法，其中，所述L-氨基酸為L-谷氨酸。
[0036] [14]如上述的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸單銨或L-谷氨酸單鈉。
[0037] [15]-種編碼磷酸鹽轉運蛋白的DNA，所述磷酸鹽轉運蛋白具有對應于SEQID N0:6中246位的苯丙氨酸殘基的氨基酸殘基被取代為絲氨酸殘基的突變。
[0038] [16] -種攜帶突變型pitA基因的棒狀桿菌型細菌，所述突變型pitA基因編碼具 有對應于SEQIDN0:6中246位的苯丙氨酸殘基的氨基酸殘基被取代為絲氨酸殘基的突變 的磷酸鹽轉運蛋白。
【具體實施方式】
[0039] 下面，對本發明詳細地進行說明。
[0040] 本發明的方法為一種L-氨基酸的制造方法，其包括在培養基中培養具有L-氨基 酸生產能力的棒狀桿菌型細菌及從該培養基中采集L-氨基酸，其特征在于，上述細菌已經 以磷酸鹽轉運蛋白的活性增大的方式進行修飾。也將相同方法中所使用的棒狀桿菌型細菌 稱為"本發明的細菌"。
[0041] 〈1>本發明的細菌
[0042] 本發明的細菌為已經以磷酸鹽轉運蛋白的活性增大的方式進行修飾的具有L-氨 基酸生產能力的棒狀桿菌型細菌。
[0043] 〈1_1>具有L-氨基酸生產能力的棒狀桿菌型細菌
[0044] 在本發明中，所謂"具有L-氨基酸生產能力的細菌"是指在培養基中培養時，具有 生成目標L-氨基酸并在培養基中或菌體內蓄積到可回收的程度的能力的細菌。具有L-氨 基酸生產能力的細菌可以為能夠在培養基中蓄積比非修飾株多的量的目標L-氨基酸的細 菌。作為非修飾株，可以舉出野生株及親株。另外，具有L-氨基酸生產能力的細菌可以為 能夠在培養基中蓄積優選0. 5g/L以上、更優選1.Og/L以上的量的目標L-氨基酸的細菌。
[0045] 作為L-氨基酸，可以舉出：L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-瓜氨 酸等堿性氨基酸；L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸等脂肪族氨基酸； L-蘇氨酸、L-絲氨酸等作為羥基單氨基羧酸的氨基酸；L-脯氨酸等環式氨基酸；L-苯丙氨 酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸；L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨 基酸；L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸；L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等側鏈具有酰胺基 的氨基酸。本發明的細菌可以具有2個或其以上的氨基酸的生產能力。
[0046] 在本發明中，氨基酸只要沒有特別記載，則均為L-氨基酸。L-氨基酸可以是游離 化合物、其鹽、或其混合物。也就是說，在本發明中，術語"L-氨基酸"可以意指游離形式的 L-氨基酸、其鹽、或其混合物。鹽的例子包括例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、和鉀 鹽。例如，L-賴氨酸可以是游離形式的L-賴氨酸、L-賴氨酸的鹽酸鹽、L-賴氨酸的碳酸 鹽、或其混合物。此外，L-谷氨酸可以是例如游離形式的L-谷氨酸、谷氨酸單鈉（MSG)、谷 氨酸單銨、或其混合物。
[0047] 作為棒狀桿菌型細菌，可以舉出屬于棒狀桿菌（Corynebacterium)屬、短桿菌 (Brevibacterium)屬、及微桿菌（Microbacterium)屬等屬的細菌。
[0048] 作為棒狀桿菌型細菌，具體而言，可以舉出如下所述的種。
[0049] 嗜乙酰乙酸棒狀桿菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)
[0050] 醋谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacteriumacetoglutamicum)
[0051] 解燒棒狀桿菌（Corynebacteriumalkanolyticum)
[0052] 帚石南棒狀桿菌（Corynebacteriumcallunae)
[0053] 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)
[0054] 百合棒狀桿菌（Corynebacterium lilium)
[0055] 棲糖蜜棒狀桿菌（Corynebacteriummelassecola)
[0056] 熱產氨棒狀桿菌（有效棒狀桿菌）（Corynebacteriumthermoaminogenes(Coryne bacteriumefficiens))
[0057] 力士棒狀桿菌（Corynebacterium herculis)
[0058] 散枝短桿菌（Brevibacteriumdivaricatum)
[0059] 黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum)
[0060] Immariophilum 短桿菌（Brevibacterium immariophilum)
[0061] 乳酸發酵短桿菌（谷氨酸棒狀桿菌）（Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))
[0062] 玫瑰色短桿菌（Brevibacteriumroseum)
[0063] 解糖短桿菌（Brevibacteriumsaccharolyticum)
[0064] 生硫短桿菌（Brevibacterium thiogenitalis)
[0065] 產氨棒狀桿菌（停滯棒狀桿菌）（Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacteriumstationis))
[0066] 白色短桿菌（Brevibacterium album)
[0067] 錯狀短桿菌（Brevibacterium cerinum)
[0068] 嗜氨微桿菌（Microbacteriumammoniaphilum)
[0069] 作為棒狀桿菌型細菌，具體而言，可以舉出如下所述的菌株。
[0070] 嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870
[0071] 醋谷氨酸棒狀桿菌ATCC15806
[0072] 解烷棒狀桿菌ATCC21511
[0073] 帚石南棒狀桿菌ATCC 15991
[0074] 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060，ATCC13869，FERMBP-734
[0075] 百合棒狀桿菌ATCC15990
[0076] 棲糖蜜棒狀桿菌ATCC17965
[0077] 有效棒狀桿菌（熱產氨棒狀桿菌）AJ12340 (FERMBP-1539)
[0078] 力士棒狀桿菌ATCC13868
[0079] 谷氨酸棒狀桿菌（散枝短桿菌）ATCC14020
[0080] 谷氨酸棒狀桿菌（黃色短桿菌）ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(FERM BP-2205)
[0081] Immariophilum短桿菌ATCC14068
[0082] 谷氨酸棒狀桿菌（乳酸發酵短桿菌）ATCC13869
[0083] 玫瑰色短桿菌ATCC13825
[0084] 解糖短桿菌ATCC14066
[0085] 生硫短桿菌ATCC19240
[0086] 產氨棒狀桿菌（停滯棒狀桿菌）ATCC6871，ATCC6872
[0087] 白色短桿菌ATCC 15111
[0088] 蠟狀短桿菌ATCC 15112
[0089] 嗜氨微桿菌ATCC15354
[0090] 另外，棒狀桿菌屬細菌中也包含以往被分類為短桿菌屬，但現在被統一為棒狀桿 菌屬的細菌（Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))。另外，停滯棒狀桿菌中也包含以往 被分類為產氨棒狀桿菌，但通過16SrRNA的堿基序列分析等而被再分類為停滯棒狀桿菌的 細菌（Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，60, 874-879 (2010)) 〇
[0091] 這些菌株例如可以由美國模式培養物保藏所（住所12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesof America)接受出售。即，賦予有與各菌株對應的注冊號，可以利用該注冊號接受出售（參照 http://www.atcc.org/)。與各菌株對應的注冊號記載在美國模式培養物保藏所的目錄中。
[0092] 本發明的細菌可以為原本具有L-氨基酸生產能力的細菌，也可以為以具有L-氨 基酸生產能力的方式進行修飾而成的細菌。具有L-氨基酸生產能力的細菌例如可通過對 如上所述的細菌賦予L-氨基酸生產能力或通過增強如上所述的細菌的L-氨基酸生產能力 來獲得。
[0093] L-氨基酸生產能力的賦予或增強可以利用以往棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細 菌等氨基酸生產菌的育種中所采用的方法來進行（參照氨基酸發酵、（株）學會出版中心、 1986年5月30日初版發行、第77~100頁）。作為如上所述的方法，例如可以舉出：營養 缺陷性突變株的獲得、L-氨基酸的類似物抗性株的獲得、代謝控制突變株的獲得、L-氨基 酸的生物合成體系酶的活性得到增強的重組株的創造。在L-氨基酸生產菌的育種中，所賦 予的營養缺陷性、類似物抗性、代謝控制突變等性質可以為單獨，也可以為2種或3種以上。 另外，在L-氨基酸生產菌的育種中，活性得到增強的L-氨基酸生物合成體系酶可以為單 獨，也可以為2種或3種以上。進而，可以組合營養缺陷性、類似物抗性、代謝控制突變等性 質的賦予和生物合成體系酶的活性的增強。
[0094] 具有L-氨基酸生產能力的營養缺陷性突變株、類似物抗性株、或代謝控制突變株 可通過將親株或野生株供于通常的突變處理，從得到的突變株中選擇顯示營養缺陷性、類 似物抗性或代謝控制突變，且具有L-氨基酸生產能力的菌株來獲得。作為通常的突變處 理，可以舉出：X射線或紫外線的照射、利用N-甲基-N' -硝基-N-亞硝基胍（MNNG)、甲磺 酸乙酯（EMS)、甲磺酸甲酯（MMS)等突變劑的處理。
[0095] 另外，L-氨基酸生產能力的賦予或增強也可以通過增強參與目標L-氨基酸的生 物合成的酶的活性來進行。酶活性的增強例如可以通過以編碼相同酶的基因的表達增強的 方式修飾細菌來進行。增強基因的表達的方法記載在W000/18935號小冊子、歐洲專利申請 公開1010755號說明書等中。對增強酶活性的詳細的方法進行后述。
[0096] 另外，L-氨基酸生產能力的賦予或增強也可以通過使催化從目標L-氨基酸的生 物合成途徑中分支而生成目標L-氨基酸以外的化合物的反應的酶的活性降低來進行。另 外，在此所謂的"催化從目標L-氨基酸的生物合成途徑中分支而生成目標L-氨基酸以外的 化合物的反應的酶"中也包含參與目標氨基酸的分解的酶。對使酶活性降低的方法進行后 述。
[0097] 以下，對L-氨基酸生產菌、及賦予或增強L-氨基酸生產能力的方法具體地進行例 示。另外，如以下例示那樣的L-氨基酸生產菌所具有的性質及用于賦予或增強L-氨基酸 生產能力的修飾均可以單獨使用，也可以適宜組合。
[0098] 〈L-谷氨酸生產菌〉
[0099] 作為L-谷氨酸生產菌或用于衍生其的親株，可以舉出選自L-谷氨酸生物合成體 系酶中的1個或其以上的酶的活性得到增強的菌株。作為這樣的酶，沒有特別限制，可以舉 出：谷氨酸脫氫酶（gdhA)、谷氨酰胺合成酶（glnA)、谷氨酸合成酶（gltBD)、異檸檬酸脫氫 酶（icdA)、烏頭酸水合酶（acnA、acnB)、梓檬酸合酶（gltA)、甲基梓檬酸合酶（prpC)、磷酸 稀醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、丙酮酸脫氫酶（aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶（pykA，pykF)、磷酸 稀醇式丙酮酸合酶（PPsA)、稀醇酶（eno)、磷酸甘油變位酶（pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶 (pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gapA)、丙糖磷酸異構酶（tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶（fbp)、 磷酸果糖激酶（pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸異構酶（pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脫水酶（edd)、 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶（eda)、轉氫酶。需要說明的是，括弧內為編碼其酶 的基因的縮寫（以下的記載中也相同）。在這些酶中，優選增強例如選自谷氨酸脫氫酶、檸 檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及甲基檸檬酸合酶中的1個或其以上的酶的活性。
[0100] 作為以谷氨酸合成酶基因（gltBD)的表達增大的方式進行修飾的棒狀桿菌型細 菌，可以舉出W099/07853中所公開的細菌。
[0101] 另外，作為L-谷氨酸生產菌或用于衍生其的親株，也可以舉出選自催化從L-氨 基酸的生物合成途徑中分支而生成L-氨基酸以外的化合物的反應的酶中的1個或其以上 的酶的活性降低或缺損的菌株。作為這樣的酶，沒有特別限制，可以舉出：異檸檬酸裂合酶 (aceA)、a-酮戊二酸脫氫酶（sucA、odhA)、磷酸轉乙酰酶（pta)、乙酸激酶（ack)、乙酰輕酸 合酶（ilvG)、乙酰乳酸合酶（ilvl)、甲酸乙酰轉移酶（pfl)、乳酸脫氫酶（ldh)、谷氨酸脫羧 酶（gadAB)、琥珀酸脫氫酶（sdhAB⑶)、1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（putA)。
[0102]a-酮戊二酸脫氫酶活性降低或缺損的棒狀桿菌型細菌及它們的獲得方法記載在TO2008/075483中。作為a-酮戊二酸脫氫酶活性降低或缺損的棒狀桿菌型細菌，具體而 言，例如可以舉出下述的菌株。
[0103] 乳酸發酵短桿菌L30-2菌株（日本特開2006-340603號說明書）
[0104] 乳酸發酵短桿菌AS菌株（國際公開95/34672號小冊子）
[0105] 乳酸發酵短桿菌AJ12821 (FERMBP-4172 ;參照法國專利公報9401748號說明書）
[0106] 黃色短桿菌AJ12822(FERMBP-4173 ;法國專利公報9401748號說明書）
[0107] 谷氨酸棒狀桿菌AJ12823(FERMBP-4174 ;法國專利公報9401748號說明書）
[0108] 谷氨酸棒狀桿菌L30-2菌株（日本特開2006-340603號）
[0109] 另外，作為L-谷氨酸生產菌或用于衍生其的親株，也可以舉出a-酮戊二酸 脫氫酶（sucA)活性及琥珀酸脫氫酶（sdh)活性兩者均降低或缺損的菌株（日本特開 2010-041920號）。作為這樣的菌株，具體而言，例如可以舉出：谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067 的odhAsdhA雙重缺損株（谷氨酸棒狀桿菌8L3GASDH菌株）（日本特開2010-041920號）。
[0110] 另外，作為L-谷氨酸生產菌或用于衍生其的親株，也可以舉出已經以增強D-木 糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性的方式進行修飾的菌株（日 本特表2008-509661)。可以增強D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性及果糖-6-磷酸磷 酸酮醇酶活性中的任一者，也可以增強兩者。需要說明的是，在本說明書中，有時將D-木 糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶統稱為磷酸酮醇酶。
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