一套用于炭疽桿菌檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一套生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一套用于炭疽桿菌檢測 的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 炭疽桿菌（Bacillusanthraci)歸屬于芽胞桿菌屬（Bacillus)。炭疽桿菌能引起 羊、牛、馬等動物及人類的炭疽病。炭疽桿菌曾被帝國主義作為致死戰劑之一。平時，牧民、 農民、皮毛和屠宰工作者易受感染，故已引起世界多國相關部門的重視。
[0003] 目前炭疽桿菌的檢測方法分為兩類，一類是傳統的培養及其改進方法，依賴于生 化與形態學特點，檢測周期較長，可操作性差；一類是聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR)相關方法，包括普通PCR方法以及實時熒光PCR方法，主要是針對炭疽桿菌 區別于芽胞桿菌屬其它細菌的多個靶基因，選擇特異序列，建立PCR以及實時熒光PCR方 法。炭疽桿菌PCR相關檢測方法近年來發展迅速，由于其快速、靈敏、特異的特性，已經成為 食源性病原微生物的可靠檢測方法。
[0004] 質粒DNA標準物質是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在 PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定 量分析的標準曲線。目前質粒DNA分子作為基因檢測的標準物質得到了越來越多的深入研 究和應用，但是針對炭疽桿菌實時熒光PCR檢測方法的質粒DNA標準物質還是空白。在實 際炭疽桿菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設計構建的質粒DNA分子作為標準品， 其中的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統一的定值方法，質粒DNA分子定值準確 度差，造成各實驗室之間的檢測結果差異極大，缺乏可比性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一套適用于炭疽桿菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標準 分子及其應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一套分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含炭疽桿菌的 大分子毒素基因PA基因序列和/或炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列。
[0007]在另一優選例中，所述炭疽桿菌大分子毒素基因PA的基因序列選自下組：
[0008] (a)序列如SEQIDNO. : 3所示的多核苷酸序列；
[0009] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. :3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0010](C)序列與SEQIDNO. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互補并且長度為SEQID NO. : 3所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0011] (d)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0012] 在另一優選例中，所述炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列選自下組：
[0013] (a)序列如SEQIDNO. :1所示的多核苷酸序列；
[0014] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0015] (c)序列與SEQIDNO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補并且長度為SEQID NO. :1所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0016] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0017] 在另一優選例中，所述多核苷酸含有炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列 和炭疽桿菌的大分子毒素基因PA序列，以及任選地連接兩種基因序列的接頭序列。
[0018] 在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. :3所示。
[0019] 在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 本發明的第二方面，提供了一套分離的DNA構建物，所述DNA構建物中包含本發明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標簽序列、酶切序列、啟動子序列和/或載體序列。
[0021] 在另一優選例中，所述DNA構建物中包含炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序 列和炭疽桿菌的毒素PA的基因序列。
[0022] 在另一優選例中，所述DNA構建物為線性DNA構建物或環狀DNA構建物。
[0023] 在另一優選例中，所述DNA構建物為質粒或表達載體。
[0024] 在另一優選例中，所述的質粒或表達載體作為炭疽桿菌檢測的標準分子（質粒標 準分子）。
[0025] 在另一優選例中，所述質粒或表達載體的骨架質粒選自下組：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0026] 在另一優選例中，所述質粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0027] 本發明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發明第一方面所述 的多核苷酸或者本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0028] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述引物對特異性擴增炭疽桿菌 大分子毒素基因PA的基因序列。
[0029] 在另一優選例中，特異性擴增炭疽桿菌大分子毒素基因PA的基因序列的所述的 引物對選自下組：
[0030]SEQIDNO. :5 和SEQIDNO. :6 所示的引物對；
[0031]SEQIDNO. :7 和SEQIDNO. :8 所示的引物對；
[0032]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物對；和
[0033]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物對。
[0034] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述所述引物對特異性擴增炭疽 桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列。
[0035] 在另一優選例中，特異性擴增炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列的引物 對選自下組：
[0036]SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物對；
[0037]SEQIDNO. : 16 和SEQIDNO. : 17 所示的引物對；和
[0038]SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物對。
[0039] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDNO. : 13 所示。
[0040] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDNO. : 20 所示。
[0041] 本發明的第四方面，提供了如本發明第一方面所述的多核苷酸、本發明第二方面 所述的DNA構建物、或本發明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于炭疽桿菌的 檢測。
[0042] 在另一優選例中，所述檢測為非診斷或治療目的。
[0043] 在另一優選例中，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
[0044] 本發明的第五方面，提供了一套炭疽桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，所采用的 標準物質是如本發明第一方面所述的多核苷酸或本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0045] 本發明的第六方面，提供了一套多核苷酸產品，所述產品包括：
[0046] (i)炭疽桿菌標準品，所述的標準品選自：本發明第一方面所述的多核苷酸或者 本發明第二方面所述的DNA構建物；
[0047] (ii)特異性擴增炭疽桿菌序列的引物對，所述引物對為：
[0048]SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的序列構成的引物對；和/或
[0049]SEQIDNO. :9和SEQIDNO. : 10所示的序列構成的引物對。
[0050]在另一優選例中，所述的產品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨立的。
[0051] 在另一優選例中，所述的產品為試劑盒形式。
[0052] 本發明的第七方面，提供了 一套炭疽桿菌的質粒標準分子的制備方法，包括以下 步驟：
[0053] ①人工合成炭疽桿菌的毒素PA基因序列和/或炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA 基因序列，所述炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列和所述毒素PA表達基因序列分 別如SEQIDNO. : 1 和SEQIDNO:3 所示；
[0054] ②將步驟①所得基因序列克隆至克隆載體上，得到炭疽桿菌的質粒標準分子。
[0055] 在另一優選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19,pUC18,pUC118,pUC119， pBlueScriptIISK或pGEM。
[0056] 在另一優選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19。
[0057] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于