一種蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于油菜分子育種技術領域，具體涉及到一種蕓薹屬植物細胞質類型的分 子檢測試劑盒及應用。
【背景技術】
[0002] 雜種優勢利用是目前國內外油菜增產的主要方法。目前，油菜雜種優勢利用的主 要途徑主要有細胞質雄性不育、細胞核雄性不育、自交不親和、化學殺雄和轉基因等方法 (傅廷棟，2000 ;官春云等，2012)。細胞質雄性不育作為雜種優勢利用的主要途徑之一，在 油菜生產上得到了很大的應用。目前生產上使用的品種中60%以上是由細胞質雄性不育 育成的雜交種。P〇lCMS不育系統在我國三系和溫敏型兩系法雜交制種中應用很廣，ogura CMS(簡寫oguCMS)在國外的油菜育種中應用較多（傅廷棟，2000)。在油菜種子生產過程 中細胞質雄性不育的利用可以降低育種成本，雜種優勢強，育種程序簡單易行。
[0003] 隨著油菜雜交育種的研究，在油菜中發現了很多不同的胞質類型，包括同源胞質 和異源胞質。其中同源胞質有，P〇lCMS胞質、nap胞質、cam胞質、ole胞質（傅廷棟，2000); 異源胞質有：〇guCMS胞質、hauCMS胞質、TourCMS胞質、kosCMS胞質，NcaCMS胞質、 NsaCMS胞質等（傅廷棟，2000;Huetal, 2002 ;萬正杰等，2006;Weietal, 2007;Wanet al, 2008)。隨著測序技術的發展，油菜中polCMS胞質、nap胞質、cam胞質、ole胞質、ogu CMS胞質、hauCMS胞質的線粒體基因組都已經測序完成（Handa，2003;Changetal，20011; Chenetal, 2011;Tanakaetal, 2012;Wangetal, 2012;Hengetal, 2014)。為了能夠 在分子水平更有效的將這些胞質區分開來，通過線粒體基因組對比，開發了不同胞質特異 的線粒體DNA分子標記，用以快速準確地鑒定甘藍型油菜不同胞質類型。這些胞質特異的 標記不僅可以用來指導甘藍型油菜胞質分類分析、指導細胞質雄性不育系和保持系以及恢 復系的選育，而且也可以用于區分新型胞質類型、以及細胞質雄性不育系純度鑒定。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供了一種蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒，該試劑 盒包括引物MSS-2、MSS-4、MSS-6、MSS-7、MSS-8、MSS-9、MSS-13、MSS-14、MSS-21、MSS-26、 MSS-6UMSS-67中的1種或2種或3種或4種或5種或6種或多種的組合。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供了一種蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒 的應用，該試劑盒在白菜、甘藍和甘藍型油菜中用于胞質類型的鑒定，區分polCMS胞質、 nap胞質、cam胞質、ole胞質、oguCMS胞質、hauCMS胞質的胞質類型，用于鑒定不同的胞 質類型和不育系純度，以加快蕓薹屬植物不同胞質類型的區分和新胞質的發現以及新品種 的培育，特別適用于甘藍型油菜細胞質類型的分子檢測。
[0006] 本發明通過以下技術方案實現：
[0007] 本發明的發明思路為：
[0008] 根據已經測序的polCMS、nap、oguCMS和hauCMS等4種甘藍型油菜胞質及甘藍 型油菜兩個祖先種白菜型油菜cam胞質與甘藍ole胞質的線粒體基因組，通過序列對比提 取出90條不同胞質類型特異的線粒體基因組序列（mitotypespecificsequences。MSSs) (圖I)，基于這些特異的線粒體基因組序列序列設計引物，開發得到一套用于蕓薹屬植物 胞質區分的SCAR分子標記組合，共包括12對SCAR引物。12對SCAR標記的名稱為：MSS-2、 MSS-4、MSS-6、MSS-7、MSS-8、MSS-9、MSS-13、MSS-14、MSS-21、MSS-26、MSS-61 和MSS-67。 利用這12對SCAR標記，可從polCMS、nap、oguCMS、hauCMS、cam、ole等6種不同胞質的 甘藍型油菜中分離出特異序列片段，擴增出的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1~N0:12所 不。
[0009] -種蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒，該試劑盒包括表1所示引物對中 的1種或2種或3種或4種或5種或6種或多種的組合。
[0010] 表1用于蕓薹屬植物細胞質類型分子檢測的SCAR標記引物序列
[0013] 所述的蕓薹屬植物優選：甘藍型油菜，白菜型油菜，甘藍。
[0014] -種蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒的應用，包括在鑒定材料polCMS 胞質、nap胞質、cam胞質、ole胞質、oguCMS胞質或hauCMS胞質中的應用；包括在胞質分 類上的應用；甘藍型油菜細胞質雄性不育系、保持系和恢復系選育上的應用和甘藍型油菜 胞質雄性不育系純度鑒定上的應用等。
[0015] 應用過程包括，利用試劑盒中的引物對待鑒定材料的DNA進行PCR，用以判定該材 料polCMS胞質、nap胞質、cam胞質、ole胞質、oguCMS胞質或hauCMS胞質的胞質類型， 判定方式如下：
[0016] MSS-2在nap和oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0017] MSS-4在nap和oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0018] MSS-6在cam和poICMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0019] MSS-7僅在ole胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0020] MSS-8僅在polCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶
[0021] MSS-9僅在polCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0022] MSS-13僅在oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0023] MSS-14僅在oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶
[0024] MSS-21僅在oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0025] MSS-26僅在hauCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0026] MSS-61在nap、cam、ole、polCMS和oguCMS胞質類型的材料中可擴增出條帶；
[0027] MSS-67在nap胞質、polCMS和oguCMS胞質材料中可擴增出條帶。
[0028] 其余的的結果則為其他類型胞質。
[0029] 本領域技術人員可根據具體需要鑒定材料的胞質類型，有效選擇上述的引物或引 物組合進行鑒定。
[0030] 用以上標記可以快速的鑒定未知蕓薹屬植物材料的胞質類型。
[0031] 更詳細的技術方案如《【具體實施方式】》所述。
[0032] 本發明的積極效果
[0033] 1?基于已經測序的polCMS、nap、cam、ole、oguCMS和hauCMS等6種不同甘藍 型油菜及其祖先種白菜型油菜與甘藍的胞質特異線粒體基因組序列，設計開發得到用于甘 藍型油菜胞質區分、鑒別的12對SCAR標記組合。
[0034] 2.本發明提供的12對特異MSS相關的SCAR標記組合可用于甘藍型油菜胞質分 類、甘藍型油菜細胞質雄性不育系、保持系和恢復系選育，以及甘藍型油菜胞質雄性不育系 純度鑒定。
【附圖說明】
[0035] 圖1為6種不同胞質類型的甘藍型油菜中胞質特異的MSS序列的可視化圖。
[0036] 圖2實施例1中的12對引物對甘藍型油菜中6種不同胞質類型PCR擴增情況示 意圖。
【具體實施方式】
[0037] 以下結合具體實施例子，進一步闡明本發明。這些實施例子僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。下列實施例子中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如《分子克隆：實驗室指南》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory, 1989)中所述 的條件，或者按照生產商提供的操作手冊中建議的方法。本發明所述實驗材料，如未特別說 明，均為市售。
[0038] 實施例1 :
[0039] 蕓薹屬植物細胞質類型的分子檢測試劑盒引物的開發及驗證：
[0040] 1. 1不同胞質類型特異標記的開發
[0041] 1)首先在GeneBank、EMBL和DDBJ三大數據庫中將已經測序完成的polCMS胞 質線粒體基因組序列（序列號：FR715249)，oguCMS胞質線粒體基因組序列（序列號： AB694744)，hauCMS胞質線粒體基因組序列（序列號：KF736092)，nap胞質線粒體基因組 序列（序列號：AP006444)，cam胞質線粒體基因組序列（序列號：JF920285)，ole胞質線粒 體基因組序列（序列號：JF920286)提取出來。
[0042] 2)利用ProgressiveMauve和BLASTN本地化軟件對這6個線粒體基因組的序列 進行對比分析（e-value:le_5)，將這六種胞質類型的線粒體基因組中共線性的以及不同 胞質類型特異的序列位點信息進行分析。根據序列位點信息將各個胞質特異的線粒體基因 組序列進行提取。從這六種不同的胞質線粒體中，總共獲得90條不同胞質類型特異的序列 MSSs(MitotypeSpecisicSequences) :5 條nap胞質特異的序列（從MSSl到MSS5) ;1 條 ole胞質特異的序列（MSS7) ;2條polCMS胞質特異的序列（MSS8和MSS9) ;13條oguCMS 胞質特異的序列（從MSSlO到