一種檢測混合肉制品中牛肉成分質量百分比的熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品質量安全檢測技術領域，具體涉及一種檢測混合肉制品中牛肉成 分質量百分比的實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 食品的質量和安全一直是社會關注的焦點，隨著人們生活水平的提高，肉制品消 費已成為食品消費的主流，要確保廣大消費者的切身利益，就要保證各種肉制品質量可靠。 目前利用肉制品摻雜摻假欺騙消費者而牟取暴利的事件屢屢出現，而且如果清真食品中摻 有豬肉成分會涉及到宗教、民族問題，不利于社會和諧穩定。肉制品的"摻雜使假"不僅嚴 重擾亂市場正常的競爭次序，而且給消費者的身心健康帶來許多負面影響，是一個世界性 的食品安全問題。因此快速準確科學檢測混合肉制品中特定肉源成分的質量百分比，對食 品安全具有重要意義。
[0003]目前，肉種的鑒定技術以蛋白質結構或DNA序列特異性這兩種主要方法。以蛋白 質為基礎的鑒定技術有一定的局限性，尤其當肉類經過加工過程，改變了蛋白質的結構，從 而破壞了物種特有的蛋白質或抗原決定部位。DNA序列方面，特別是實時熒光PCR技術的出 現，實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且它采用了完全閉管檢測，避免了交叉污染，可實 行自動化操作且耗時短，已成為分子生物學研究中的重要工具，亦被應用于食品監測中，是 現行的行業標準中指定的方法之一。該技術在一定意義上可對目標基因進行定量，從而實 現定量檢測。當前實時熒光PCR技術在食品相關檢測研究中主要還是運用在轉基因成分的 定量，食品成分方面的應用局限于少數產品中，牛肉的定量檢測方面目前在國內外報道較 少。現有檢測標準主要是對食品中牛源性成分的定性檢測，但是目前無針對肉制品中牛肉 成分含量（w/w)的定量檢測標準，使得監管部門很難判定違法廠商的責任。
【發明內容】
[0004]針對現有技術中所存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種快速測定混合肉制品 中牛肉成分質量百分比的試劑盒，所述試劑盒可以簡便、快速、安全、特異性地定量檢測出 混合肉制品中牛肉成分的質量百分比。本發明還提供用該檢測試劑盒檢測混合肉中牛肉質 量百分比的方法，對食品安全檢測具有重要意義。
[0005]本發明的主要原理：以系列牛肉質量百分比的混合肉樣基因組DNA模板作為標準 品。通過熒光PCR儀擴增標準樣品中真核生物通用基因和牛特異性基因的熒光強度后，制 成牛肉質量百分比與ACt的標準曲線。最終在檢測時將提取的待測樣品DNA分別置于真 核生物通用檢測體系和牛特異性檢測體系中，經檢測熒光強度得到ACt并對照標準曲線 實現牛肉成分質量百分比的定量檢測。
[0006]本發明是通過以下技術方案來實現的：
[0007]本發明的第一方面，提供了一種檢測混合肉制品中牛肉成分質量百分比的熒 光定量PCR檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括：總DNA提取試劑，DNA純化試劑，18S熒 光定量PCR預混液試劑，Beef熒光定量PCR預混液試劑，標準品；所述的18S熒光定 量PCR預混液試劑是真核生物通用基因檢測的擴增反應液，其包括真核生物通用寡核 苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，具體為： 5' -CTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示，具體為： 5' -TAATTTGCGCGCCTGCTG-3' ；所述的Beef熒光定量PCR預混液試劑是牛特異性基因檢測 的擴增反應液，其包括牛特異性寡核苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO: 3所示，具體為：5' -GGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3'，下游引物的核苷酸序列 物如SEQIDN0:4 所示，具體為：5' -GGATTGCTGATAAGAGGITGGTG-3'。
[0008] 所述真核生物的通用寡核苷酸引物是根據真核生物核糖體小亞基18SrRNA基因 序列的保守序列設計的。所述牛特異性寡核苷酸引物是根據不同動物物種之間線粒體細胞 色素b基因上的DNA序列多態性設計的。所述真核生物的通用寡核苷酸引物和牛特異性寡 核苷酸引物的組合使用是本發明試劑盒的關鍵，本發明的兩組引物對具有相似屬性，包括 引物Tm值、擴增產物長度等，從而最大限度地降低了測試過程中的系統誤差。
[0009] 優選地，所述總DNA提取試劑包括TNE裂解液、鹽酸胍溶液和蛋白酶K溶液；所 述TNE裂解液組成成分及終濃度為：10mmol/LTris，150mmol/LNaCl，2mmol/LEDTA， lg/100mLSDS;所述鹽酸胍溶液的終濃度為5mol/L的；所述蛋白酶K溶液的終濃度為 20mg/mL〇
[0010] 優選地，所述DNA純化試劑購于Promega公司的Wizar膽>DNAClean-UpSystem;
[0011] 優選地，所述18S焚光定量PCR預混液試劑每個檢測單位由10IiL2xQuantiFast SYBRGreenPCRMasterMix，0.4yL上游引物，0.4yL下游引物，5.2yLCldH2O組成；所述 上游引物和下游引物的濃度均為10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBRGreenPCRMaster Mix購于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit〇
[0012] 優選地，所述Beef熒光定量PCR預混液試劑每個檢測單位由10yL2x QuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix，0. 4yL上游引物，0.4yL下游引物，5. 2yL ddH20組成；所述上游引物和下游引物的濃度均為10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBR GreenPCRMasterMix購于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit0
[0013] 優選地，所述標準品由系列牛肉質量百分比的混合肉樣基因組DNA模板組成； 所述系列牛肉質量百分比的混合肉樣分別為牛肉質量百分比〇. 05%，0. 1 %，0. 5%，1 %， 2. 5%，5%，20%，45%，100% 的混合肉樣。
[0014] 優選地，所述試劑盒中還含有陽性對照，所述陽性對照為純牛肉基因組DNA。
[0015] 優選地，所述試劑盒中還含有陰性對照。所述陰性對照為非牛肉基因組DNA。
[0016] 優選地，所述試劑盒中還含有空白對照。所述空白對照不含DNA模板，可以CldH2O 代替。
[0017] 優選地，所述試劑盒中還含有使用說明書，便于本領域技術人員使用本發明的試 劑盒。
[0018] 進一步的，本發明的第二方面，還提供了一種采用前述試劑盒檢測混合肉制品中 牛肉成分質量百分比的方法，包括下述步驟：
[0019] 1)待測樣品前處理：稱取2g待測樣品至50mL離心管，加入20mLPBS緩沖液，研 磨儀研磨80s，每組樣品設有6個平行樣。所述的PBS緩沖液購于上海生工生物工程有限公 司，或由磷酸二氫鉀（KH2PO4)、磷酸氫二鈉（Na2HPO4)、氯化鈉（NaCl)、氯化鉀（KCl)自配成 PBS緩沖液；
[0020] 2)DNA提取和純化：取IOOmg樣品勻漿液與2.OmL離心管中，加入860 yL的TNE 裂解液、100 yL的鹽酸胍溶液，40 yL的蛋白酶K溶液，充分混勻；60°C溫浴4h;冷卻至室 溫，16700g離心15min，取500 yL的DNA上清液加入到2mL離心管中；加入ImL的WizarcT DNAClean-UpResin混合徹底，移至連接有'Wizard?'Minicolumn的5mL注射管中；按壓注 射器的內芯，將混合物洗脫在Wizard8'Minicolumn并棄濾液；取下Wizard81Minicolumn后 拔出注射器內芯并重新連接到注射管，添加2mL的80%異丙醇，按壓注射器內芯洗滌棄濾 液；將Wizard'8'Minicolumn轉移到I. 5mL離心管，1000 Og離心 2min，靜置 5min;將Wizard* Minicolumn移至新的I. 5mL離心管上，加入50yLpH8. 0的TE緩沖液靜置lmin，1000 Og 離心30s洗脫得到純化的DNA模板；提取的DNA質量用核酸蛋白分析儀進行測定，當OD26q/ OD28。比值在1. 7~2. 0之間時，適宜于PCR擴增，將DNA稀釋至5ng/yL;所述的TNE裂解 液、鹽酸胍溶液、蛋白酶K溶液包括在所述檢測混合肉制品中牛肉成分質量百分比的熒光 定量PCR檢測試劑盒的總DNA提取試劑中；所述的WizarcfDNAClean-UpResin和Wizarcf Minicolumn包括在所述檢測混合肉制品中牛肉成分質量百分比的熒光定量PCR檢測試劑 盒中的DNA純化試劑中；所述的異丙醇溶