人類mthfr和mtrr基因多態性檢測引物和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及生物技術領域，具體的，涉及人類MTHFR和MTRR基因多態性檢測引物、 探針和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 葉酸（FolicAcid)是指具有相關生物活性的一類同效水溶性B族維生素，其在機 體內的活性形式為5-甲基四氫葉酸，為細胞生長和繁殖的必須物質，參與體內很多重要的 代謝反應。作為體內一碳單位的傳遞體，葉酸參與嘌呤、胸腺嘧啶、核苷酸等多種物質的合 成和轉化，同時影響磷脂、肌酸、神經介質的生成，促進神經細胞與腦細胞發育。葉酸缺乏會 導致高同型半胱氨酸血癥，引起機體出現多系統損傷，是新生兒神經管缺陷，癌癥、慢性萎 縮性胃炎、結腸炎、肝細胞受損、血栓閉塞性心臟病、巨幼紅細胞性貧血和白細胞減少癥、抑 郁癥、動脈粥樣硬化及其他心血管疾病的重要危險因素之一。
[0003] 5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)能催化5, 10-亞甲基四氫葉酸產生5-甲 基四氫葉酸，參與甲基傳遞與核苷酸合成，是葉酸代謝過程中的關鍵酶。其基因位點突變對 酶的活性和熱穩定性產生影響，從而影響葉酸和甲硫氨酸代謝。該基因最常見的兩個單核 苷酸多態性677C>T和1298A>C，在中國發生率分別為45. 2%和18. 6%。MTHFR677C>T突變 可造成其編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，引起耐熱性和酶活性下降，雜合MTHFR677CT 酶活性下降30%，純合677TT酶活性下降65 %以上，在低葉酸的環境下，純合677TT可顯 著升高血漿同型氨酸濃度，從而引起靜脈栓塞、肺栓塞、動脈粥樣硬化、腦卒中等疾病，攜帶 MTHFR677TT基因型的母親在低葉酸環境情況下生育神經管缺陷的病兒的風險也大大增 加。MTHFRA1298C突變引起編碼的氨基酸由谷氨酸轉變為丙氨酸，也會導致酶活性下降，但 下降程度比MTHFRC67H突變輕微，文獻報道與高同型胱氨酸血癥無直接關系，但與MTHFR C677T突變有協同效應。甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR)主要作用是將失活的甲硫氨酸合成 酶還原為活性狀態，維持甲基傳遞通路繼續進行，使得體內的同型半胱氨酸保持在無毒水 平。其報道最多的單核苷酸多態性是66A>G，中國人群發生率為25. 7 %，突變導致其酶活與 同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血癥。MTHFR和MTRR基因多態性如 表1所示。
[0004] 表I:MTHFR和MTRR基因多態性
[0005]
[0006] 目前針對基因多態性的檢測方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶 解曲線檢測法（HighResolutionMeltingAnalysis，HRM)，焚光定量PCR法等。其中最常 見方法為測序法，該方法費用較低，但操作耗時長且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對設備 要求比較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統熒光定量PCR法在臨床上應用較為廣泛， 但該方法檢測基因多態性一般采用Genotyping方法進行檢測，該方法對樣本數量以及多 態性分布有一定要求，樣本量少時不能對樣本基因多態性進行準確檢測。因此，需要建立一 種快速有效的檢測少量樣本的MTHFR和MTRR基因多態性的方法。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于，克服現有技術中的不足，提供同時檢測人類MTHFR和MTRR基 因多態性的特異性引物序列和試劑盒，以此解決現有基因多態性檢測技術中，樣本量少時 基因多態性檢測效果不理想的問題。
[0008] 本發明提供了同時檢測人類MTHFR和MTRR基因多態性的特異性引物序列，所述特 異性引物序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1-9所示。
[0009] 本發明還提供了一種用于同時檢測人類MTHFR和MTRR基因多態性的檢測試劑盒， 其中，所述試劑盒中含有本發明所述的特異性引物序列。
[0010] 所述檢測試劑盒中還含有3組特異性探針，所述3組特異性探針的核苷酸序列分 別為SEQIDNO: 10 與SEQIDNO: 11，SEQIDNO: 12 與SEQIDNO: 13,SEQIDNO: 14 與SEQ IDNO: 15,且所述特異性探針的5'端修飾有FAM或VIC，3'端修飾有NFQ-MGB。
[0011] 本發明的人類MTHFR和MTRR基因多態性檢測試劑盒采用Taqman探針法，建立了 在同一反應管檢測同一基因兩種不同多態性的多重熒光定量PCR檢測方法，另外本發明 MTHFR和MTRR基因多態性檢測試劑盒采用ARMS引物特異性擴增目的模板與SNP探針特異 性檢測目的模板方法，對特異性檢測同一基因兩種多態性提供雙重保證，同時引入內標系 統和UNG酶防污染系統，能更加準確、穩定地對樣品進行分型檢測。本發明的試劑盒具有以 下優點：1.可以準確檢測單個樣品的基因型；2.可以準確檢測Ing基因組DNA的基因型； 3.針對MTHFR和MTRR的基因型設計ARMS引物和SNP分型探針，可以特異性擴增識別對應 的多態性；4.使用熒光定量PCR技術進行檢測，檢測過程均為閉管反應，顯著降低污染，并 且加入UNG酶防污染系統，確保結果真實可信；5.在同一反應管中檢測同一基因兩種多態 性，操作簡便，能在90分鐘內完成檢測，結果判讀方法簡單客觀，便于分析。
[0012] 本試劑盒對人類MTHFR基因677C>T和1298A>C位點和MTRR基因66A>G位點的多 態性進行定性檢測，可輔助醫生對孕圍產期新生兒神經管畸形、妊娠高血壓病等疾病的發 病風險進行評估，指導葉酸的個體化服用，但不能以本試劑盒檢測結果作為臨床診斷唯一 依據。本方法的優點在于檢測過程全封閉、檢測時間短。
【附圖說明】
[0013] 圖1為MTHFR677C/C純合野生樣本6例檢測結果；
[0014] 圖2為MTHFR67H/T純合突變樣本3例檢測結果；
[0015] 圖3為MTHFR677C/T雜合突變樣本7例檢測結果；
[0016] 圖4為MTHFR1298A/A純合野生樣本10例檢測結果；
[0017] 圖5為MTHFR1298A/C雜合突變樣本6例檢測結果；
[0018] 圖6為MTRR66A/A純合野生樣本8例檢測結果；
[0019] 圖7為MTRR66A/G雜合突變樣本8例檢測結果。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施僅僅用以 解釋本發明，并不限定本發明。
[0021] 本發明的一個方面提供了同時檢測人類MTHFR和MTRR基因多態性的特異性引物 序列，其中，所述特異性引物序列的核苷酸序列如SEQIDNo. 1-9所示。
[0022] 其中，SEQIDNO: 1 與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4 與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7 與SEQIDN0:8為普通PCR引物，分別擴增包含MTHFR677、MTHFR1298、MTRR66基因多態 性的DNA片段；其中SEQIDNO: 3、SEQIDNO: 6、SEQIDNO: 9為ARMS引物，用于分別特異 性擴增含有MTHFR677、MTHFR1298、MTRR66三個位點特異性DNA片段。3條ARMS引物分 別在3'模板堿基與待擴增類型的堿基配對，同時在其3'末端倒數第2-3位增加一個或者 兩個堿基錯配，以增強擴增時的特異性。
[0023] 各引物序列列舉如下：
[0024] MTHFR677 上游引物 5' -ATTGGCAGGTTACCCCAAAG-3'
[0025] MTHFR677 下游引物 5 ' -ATGCCTTCACAAAGCGGAAG-3，
[0026] MTHFR677ARMS引物 5' -AAAGCTGCGTGATGATGAAATGAG-3'
[0027] MTHFR1298 上游引物 5 ' -CTGAAGAGCAAGTCCCCCAAG-3 '
[0028] MTHFR1298 下游引物 5 ' -CACTCCAGCATCACTCACTIT-3，
[0029] MTHFR1298ARMS引物 5 ' -GGAGGAGCTGACCAGTGAACA-3 '
[0030] MTRR66 上游引物 5 ' -CCCATTTTTCAGTTTCACTGTTA-3 '
[0031] MTRR66 下游引物 5 ' -TCAAAGCACAAAACGGTAAAATCCAC