一種rapd標記竹節參及其近緣植物的品種鑒別的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種近緣植物品種鑒定的方法，具體為采用RAro標記竹節參及其近 緣植物的品種鑒別方法。
【背景技術】
[0002] 竹節參為五加科人參屬植物竹節參PanaxjaponicusC.A.Mey?的干燥根莖，具有 滋補強壯、散瘀止痛、止血、祛痰的功效，用于病后虛弱，勞嗽咯血，咳嗽痰多，跌撲損傷，因 此兼具我國北藥人參的滋補強壯和南藥三七的活血散瘀的作用，是我國西南地區土家族、 苗族等聚居區常用中草藥。與《中華人民共和國藥典》規定不一致的是，民間也常把竹節參 的三種變種狹葉竹節參PanaxjaponicusC.A.Mey.var.angustifius(Burk)ChengetChu、 羽葉三七PanaxjaponicusC.A.Mey.var.bipinnatidus(Seem.)C.Y.WuetK.M.Feng、珠子 參PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.WuetK.M.Feng的干燥根莖混用作 竹節參，然而研究表明，它們的化學成分以及藥理活性不盡相同，因此，尋找有效方法鑒別 這些藥材，對于合理用藥具有重要意義。
【發明內容】
[0003] 為了將竹節參與其易混淆人參屬近緣植物（人參、西洋參、三七以及竹節參變種 狹葉竹節參、羽葉三七、珠子參）鑒別區分開，本實驗通過RAro分子標記技術，構建人工繪 制品種鑒定圖（MCID)，建立竹節參及其近緣植物的基因鑒別體系。
[0004] 材料
[0005] 竹節參、狹葉竹節參、羽葉三七以及珠子參的葉片新鮮品均采購于湖北恩施椿木 營竹節參種植生產基地，三七葉片新鮮品采購于云南文山硯山縣者臘鄉，人參、西洋參的葉 片新鮮品購自于吉林省白山市靖宇縣。采集后用硅膠迅速干燥備用。試劑
[0006] PCR擴增試劑（ThermoScientific公司，批號 00140623)、CTAB(AMRESC0 公司，批 號 3186B058)、PVP40(Sigma公司，批號BCBD7485)、瓊脂糖（BI0WEST公司，批號 111860)、 GelRed染料（BI0TIUM公司，批號 13G0307)、RNaseA酶（Sigma公司，批號 036M1298G)、DNA 上樣緩沖液（武漢科瑞生物技術有限公司，批號20150116)、lkbplusDNALadder[天根生 化科技（北京）有限公司，批號M2206]。RAPD隨機引物由上海生工公司合成。其余試劑均 為分析純。
[0007] 儀器
[0008] BS110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、HH-4數顯恒溫水浴鍋（常 州國華電器有限公司）、CT15RT高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限公司）、 梯度PCR儀（AppliedBiosystems)、DYY_6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、GeneGenius 凝膠分析系統（英國SYNGNE公司）、LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀 器有限公司）。
[0009] 方法
[0010] 一種RAro標記竹節參及其近緣植物的品種鑒別的方法，包括如下步驟：
[0011] DNA的提取用液氮將研缽、大小杵，藥匙預冷，分別稱取竹節參葉片、近緣植物葉 片，分別與聚乙烯吡咯烷酮置于液氮中，研磨成細粉，將研磨好的細粉轉移至離心管中，加 入預冷至4°C的去多糖緩沖液，混勻后于冰上靜置30min，在4°C下，離心棄上清；往離心管 加入65°C預熱的2X十六烷基三甲基溴化銨提取液，65°C水浴40min，每隔IOmin上下顛倒 混勻一次；取出I. 5mL離心管，冷卻至室溫，離心，取上清，加入等體積的氯仿與異戊醇的混 合液（其中，氯仿與異戊醇的體積比為24 :1)，混勻IOmin后，離心，取上清，重復離心取上 清液至新的I. 5mL離心管，加入0. 6倍體積-20°C預冷的異丙醇，混勻，于_20°C靜置lh，在 4°C下，離心得沉淀物；沉淀物用70%乙醇洗滌2次，95%無水乙醇洗滌1次，吹風機冷風吹 干液體，干燥后，加入滅菌雙蒸水和核糖核酸酶（RNaseA)，37°C水浴lh，于_20°C保存備， 即可得到提取的DNA;
[0012] PCR反應體系將上述得到的DNA在PCR反應液下進行擴增反應，其擴增程序為預 變性、然后是變性、退火、延伸，共進行39個循環，最后延伸確定得到穩定的擴增產物，即為 PCR反應產物，同時PCR擴增反應均設不含模板DNA的空白對照；
[0013] RAPD引物篩選收集RAPD引物，應用軟件比對后篩選隨機引物，再將隨機引物經過 RAH)的PCR中篩選出擴增竹節參及其近緣植物中DNA條帶清晰、重復性好的引物，進行電 泳，凝膠分析系統檢測照相；
[0014] 數據分析根據隨機引物PCR擴增電泳圖譜，將相同的分子量片段處產生特異性條 帶的有無進行統計，利用特異性條帶的有無可將竹節參及其近緣植物分組，使用多個隨機 引物的分組結果的組合，可以將竹節參及其近緣植物一一區分開來，即可完成品種鑒別。
[0015] 所述的竹節參的近緣植物包括人參，西洋參，三七，珠子參，羽葉三七，狹葉竹節參 中的一種或多種。
[0016] DNA提取步驟中，第一次離心是在4°C下，以3000r?min1下離心5min，其他離心 是在相應溫度下12000r?min1下離心lOmin。
[0017] 所述的去多糖緩沖液是不含CTAB的低鹽清洗液，能夠有效地去除多酚、多糖、色 素等雜質；去多糖緩沖液、2X十六烷基三甲基溴化銨提取緩沖液中均含有質量分數為2% 的巰基乙醇；每200mg葉片中加入700yL去多糖緩沖液，700yL2X十六烷基三甲基 溴化銨提取緩沖液。
[0018] ?0?反應液包括25禮的]\%(：12、10\了&9 1311打61￥行111((：1、11]/1^的1&9酶、1〇1111 的dNTPMixture、IOmM引物（10個堿基的RAPD隨機引物）按體積比為6:5:3:1:4的混合 原料，其他為滅菌雙蒸水。
[0019] 所述的IOXTaqbufferwithKCl為IOOmMTris-HCl(Ph8. 8)，500mMKCl，0.8% (v/v)NonidetP40 的混合物。
[0020] DNA的擴增程序為 90-98°C預變性 3-10min;92-98°C變性 35-65s，30-40°C退火 33-96s，65-80°C延伸 60-120s，循環 35-42 次；70-75°C補充延伸 5-10min。
[0021] 進一步優選為，DNA的擴增程序為94°C預變性5min;94°C變性45s，36°C退火60s， 72°C延伸90s，循環39次；72°C補充延伸7min。
[0022] 篩選的RAI3D引物包括 (GAGGATCCCT)、113 (CTCTCCGCCA)、H03 (AGACGTCCAC)、 FOl(ACGGATCCTG)。
[0023] 鑒別人參的帶型為R)2引物擴增的IIOObp⑴700bp(_)和113引物擴增的 800bp(+);鑒別西洋參的帶型為R)2引物擴增的IIOObp⑴700bp(-)和113引物擴增 的800bp(_);鑒別竹節參的帶型為R)2引物擴增的1100bp(-)700bp(+)，H03引物擴增 的300bp(+)以及113引物擴增的450bp(+);鑒別狹葉竹節參的帶型為R)2引物擴增的 1100bp(-)700bp(+)，H03引物擴增的300bp(_)以及R)1引物擴增的500bp(+);鑒別羽葉 三七的帶型為H)2引物擴增的1100bp(-)700bp(+)，H03引物擴增的300bp(_)以及R)1 引物擴增的500bp(_);鑒別珠子參的帶型為R)2引物擴增的1100bp(-)700bp(+)，H03引 物擴增的300bp(+)以及113引物擴增的450bp(_);鑒別三七的帶型為R)2引物擴增的 1100bp(-)700bp(-)。其中有特異性條帶用（+)表示，無特異性譜帶用（-)表示。
[0024] 竹節參是我國民間珍稀傳統中草藥之一，具有抗炎、抗心肌缺血、抗疲勞等多種藥 理活性，