一種提高阿維菌素產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提高阿維菌素產量的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]阿維菌素(Avermectins, AVM)是由格蘭氏陽性菌阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)產生的一類十六元環大環內脂類抗生素。根據連接基團的不同，把阿維菌素分成8個組分即Ala、A2a、Alb、A2b、Bla、B2a、Blb和B2b，其結構差異主要集中在3個部位即C5、C22-C23及C26上，其中BI組分活性最大，尤以Bla的驅蟲活性最強。阿維菌素具有高效、安全、農、牧、醫三用等特點，阿維菌素是目前世界上公認的最有效的無公害生物殺蟲劑之一，在常用劑量下對人畜安全，不破壞生態系統。隨著人們生活水平的不斷提高以及人們對綠色食品的需求，生物農藥在市場需求中倍受青睞。目前，阿維菌素在基因水平上的生物合成研究已經取得了突破性的進展，其大部分生物合成途徑得到闡明，相關的阿維菌素生物合成基因簇已經被成功克隆，且多數基因的功能也基本明確。尤其是對產生阿維菌素的關鍵調控基因和功能基因的研究也取得了較大的進展，陸續發現了調控阿維菌素產量的相應關鍵基因，如aveR, malE, sig25and orfX等。現今，關于提高阿維鏈霉菌發酵效價及縮短發酵周期的主要技術手段包括:利用各種誘變劑(紫外線UV、亞硝酸HN03)處理微生物細胞，提高細胞基因突變頻率，篩選高產菌株；基因工程技術定向改造細胞，獲得高產菌株；優化菌株發酵培養條件，提高菌體發酵效價等。但是，這些技術手段在實際應用中都存在著不少缺點。例如，誘變劑容易誘導菌株發生耐受性，從而導致負突變大量增加，正突變急劇減少甚至消失。基因工程菌的應用主要受限于人們對阿維鏈霉菌基因結構的研究進展程度，由于現在其基因結構還未完全被徹底得到闡明，因此至今還無法構建成熟穩定的工程菌；對于確定的菌株來說，當其生長因子、無機鹽、溫度等外界因素達到最優組合時，則不能繼續提高其抗生素產量。總之，到目前為止，以上技術手段還不能穩定、有效地縮短阿維鏈霉菌發酵周期，阿維菌素產量提高從而受到限制，這種現狀已經成為制約阿維菌素工業發展的一個主要瓶頸問題。
[0003]納秒脈沖電場技術是21世紀新興物理技術，它具有脈寬短(ns)，場強高(kV/cm)，能量低(mj/cc)，作用前后不會產生熱量變化等眾多特點。近期，納秒脈沖電場在腫瘤治療、協同化療藥物殺傷腫瘤，細胞內鈣離子調控、血小板凝膠、細胞膜通透性調控等眾多生物醫學領域引起了學者們的廣泛關注。尤其在近期的研究中發現脈沖電場能夠有效促進梭梭樹種子的萌發、擬南芥的生長發育以及軟骨細胞的增殖效果，但機制還有待進一步研究。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種提高阿維菌素產量的方法，本發明采用納秒脈沖功率技術處理阿維鏈霉菌孢子能有效上調產生阿維菌素的關鍵基因aveR和malE的表達，促進阿維菌素的生物合成過程；同時，還能夠明顯縮短阿維鏈霉菌的發酵周期，大幅度提高阿維菌素產量。
[0005]本發明提供的提高阿維鏈霉菌產生阿維菌素的量的方法，包括如下步驟:1)將阿維鏈霉菌孢子溶液用納秒脈沖功率技術刺激處理；
[0006]2)將步驟I)處理的所述阿維鏈霉菌孢子溶液置于培養基中培養，使合成的阿維菌素產量得到提高。
[0007]本發明中，所述阿維鏈霉菌孢子代謝產生阿維鏈霉菌，阿維鏈霉菌合成阿維菌素。
[0008]本發明中，所述納秒脈沖功率技術為非熱效應的脈沖電場序列。
[0009]上述的方法中，所述納秒脈沖功率技術的脈沖寬度可為30?100ns，具體可為10ns ；
[0010]所述納秒脈沖功率技術的電場強度可為5?20kV/cm，具體可為5kV/cm、10kV/cm、15kV/cm、10 ?15kV/cm 或 5 ?15kV/cm ；
[0011 ] 所述納秒脈沖功率技術的脈沖頻率可為0.1?2Hz，具體可為IHz。
[0012]上述的方法中，步驟2)中，所述培養的周期可為9?lld，具體可為9d，經過納秒脈沖功率技術刺激后阿維菌素產量平臺期出現時間從原來的第7天提早到現在的第5天。
[0013]上述的方法中，所述納秒脈沖功率技術采用納秒脈沖電場發生器。
[0014]上述的方法中，所述阿維鏈霉菌孢子溶液的制備過程為將長有所述阿維鏈霉菌孢子的平板培養基用PBS緩沖溶液沖洗，過濾掉阿維鏈霉菌的菌絲，即得到純的所述阿維鏈霉菌孢子溶液。
[0015]上述的方法中，所述阿維鏈霉菌采用ATCC31267型菌株。
[0016]本發明中，所述PBS 緩沖溶液的組成為 NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.44g/L和KH2PO4 0.24g/L，所述PBS緩沖溶液的PH為7.4 ;使用前需經高溫滅菌。
[0017]本發明中，除了納秒脈沖功率技術處理外，培養阿維鏈霉菌和分離獲得阿維菌素的方法，與現有技術相同。
[0018]本發明具有以下優點:
[0019]本發明采用納秒脈沖功率技術處理阿維鏈霉菌孢子，有效上調產生阿維菌素的關鍵基因aveR和malE的表達，促進阿維菌素的生物合成過程，同時還能夠明顯縮短阿維鏈霉菌的發酵周期，大幅度提高阿維菌素產量，克服阿維鏈霉菌現有發酵技術存在的周期長、效價低的不足的問題，同時納秒脈沖功率技術裝置耗能很低，操作簡便，有效降低生產成本。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明實施例中采用的納秒脈沖功率技術的裝置圖。
[0021]圖2為本發明實施例1中對阿維菌素產量的檢測，其中圖2(a)為檢測阿維菌素在紫外波段OD = 245nm處的典型特征吸收峰，圖2 (b)為納秒脈沖功率技術處理使阿維鏈霉菌產量平臺期縮短檢測結果柱狀圖。
[0022]圖3為本發明實施例1中實時定量RT-PCR技術檢測納秒脈沖功率技術刺激阿維鏈霉菌后的關鍵基因表達變化情況柱狀圖，其中圖3(a)為aveR基因表達的結果，圖3(b)為malE基因表達的結果，圖3 (c)為sig25基因表達的結果。
[0023]圖4位本發明納秒脈沖功率技術刺激前后的阿維鏈霉菌在固體培養基上分別培養了 1、3、5、7和9天的形態學變化，其中C代表對照組阿維鏈霉菌，5、10和1