一種高效對結縷草進行轉基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種高效對結縷草進行轉基因的方法。
【背景技術】
[0002]結縷草為多年生草本植物，分布在朝鮮、日本以及中國的河北、安徽、江蘇、浙江、福建、山東、東北、臺灣等地，生長于海拔200米至500米的地區，多生在山坡、平原和海濱草地。
[0003]結縷草具有較強大的根莖、粗糙堅硬的葉子，所以耐踐踏；又具有耐干旱、耐痔薄、耐低修剪的優點；同時適應的土壤范圍廣；被廣泛用于運動場草坪、觀賞草坪、高爾夫球場、庭院綠化、水土保持等諸多方面。然而，結縷草也有不少缺點，如在自然條件下發芽率很低，種子發芽慢；在高溫潮濕的條件下容易染銹病、褐斑病和幣斑病；在10-12.8°C之間就開始腿色等等。因此，對結縷草進行耐寒、耐溫等方面的培育就顯得至關重要，而基因改造是其中的主要手段之一。
[0004]不過，在結縷草的基因改造方面，一直存在低轉化率和需進行長時體外培養的問題，這大大限制了結縷草優良品種選育工作的開展。
[0005]在現有研究中，基因槍轉化法和農桿菌介導轉化法是常用的轉基因方法。在進行轉基因操作時，匍匐莖節、原生質體、懸浮細胞、植物分生干細胞和胚性愈傷組織等均可作外植體，其中胚性愈傷組織較為常用。
[0006]然而，利用上述外植體時，轉化率不僅較低，更重要是的體外培養時間較長，且操作復雜。具體而言，由于結縷草生長較為緩慢，胚性愈傷組織的形成時間大約為3個月，因此在轉基因前至少需進行3個月的胚性愈傷組織的篩選工作，極大的阻礙了結縷草優良品種選育工作的開展。
[0007]另外，胚性愈傷組織的誘導率低，通常需要經驗豐富操作人員來辨別挑選；而懸浮細胞和原生質體需要長時間的專業培養，這些操作的復雜度更進一步延緩了本領域工作的進程。
[0008]因此，亟需尋找一種操作簡便、轉化率高且耗時較短的結縷草的轉基因方法。
【發明內容】
[0009]針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種高效對結縷草進行轉基因的方法，該方法不僅操作簡便、轉化率高，更重要的是所需時間非常短，該方法包括如下步驟:
O從結縷草成熟種子中切剝分離出成熟胚，置于愈傷誘導培養基中培養；培養至長出胚根、胚芽，或培養至在胚根胚芽基部出現愈傷組織；
2)將步驟I)誘導所得物于滲透培養基中預培養6-8小時；
3)利用基因槍轉化法，將外源基因轉入步驟2)所得物。
[0010]本發明的發明人經過大量實驗摸索發現，利用上述方法對結縷草進行轉基因操作，因為省去了胚性愈傷組織誘導的過程，這一過程在結縷草上通常需要2-3個月，使原本需要約3個月的實驗縮減為不到10天。并且獲得了較高的瞬時轉化率(轉入基因材料與待轉材料的比例)，可達50%以上。
[0011]在植物的轉基因工作中，由于物種特性的差異性較大，各物種最佳的轉基因方法也不盡相同；同時，對于某種或某類植物而言，如何提高其基因轉化率和操作所需時間，也尚未達成共識。如《植物轉基因技術的進展存在問題及突破方向》(董福雙，河北農業科學，2011，15(3): 57-65)所記載，利用不同轉化方法對不同作物進行轉基因操作，轉化率的差異十分巨大，轉化率可低至小于0.5%，且可重復性差。
[0012]本發明的發明人創造性的以經過預培養的成熟胚作為外植體，并利用基因槍轉化法進行轉基因操作，令人驚喜的獲得了高于50%的瞬時轉化率，最高可達62.95%。本領域人員應當知曉，利用僅僅需要預培養幾天的成熟胚作為外植體，并直接將其進行轉基因操作，所需的時間是非常短的。因此，本領域人員應當理解，本發明的貢獻在于在大幅縮短結縷草轉基因過程所需的時間的前提下，獲得了優異的結縷草轉基因的轉化率。
[0013]優選的，所述愈傷誘導培養基的組分包括包括MS基礎培養基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g Lmg L 1維生素Bl、100 mg L 1C1-酮戊二酸、5 mg L12，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L 芐氨基腺嘌呤；所述愈傷誘導培養基的pH值為5.8，用2gL 1植物凝膠固化。
[0014]所述步驟I)的培養時間為1-8天。優選的，所述培養時間為1-4天。更優選的，所述培養時間為1-2天，以胚根剛從胚中長出為準。最佳培養時間為3-4天，以胚根繼續生長，胚芽開始出現，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出現愈傷組織為準。
[0015]以胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出現愈傷組織的預培養成熟胚作為外植體時，如本發明的實施例所示，所得的轉化率最高。
[0016]優選的，所述滲透培養基的組分包括包括MS基礎培養基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g Lmg L 1維生素Bl、100 mg L 1C1-酮戊二酸、5 mg L12，4- 二氯苯氧乙酸、0.2 mg L '6-芐氨基腺嘌呤、0.3M山梨糖醇、0.3M甘露醇；所述滲透培養基的PH值為5.8，用2g L 1植物凝膠固化。
[0017]優選的，所述方法還包括在步驟I)前對結縷草成熟種子進行預處理，和/或，在步驟3)之后將轉化后的所得植物組織于滲透培養基中繼續培養至少24小時后再轉入愈傷組織繼代培養基(與愈傷誘導培養基基本相同，除了 2，4-D濃度改為2 mg L 3中培養；
所述預處理步驟包括:
A)將種子在水中浸泡2天；
B)置于含1%活性氯的次氯酸鈉溶液中攪拌滅菌2小時，然后用無菌水反復清洗。
[0018]優選的，所述基因槍轉化法包括步驟:
所述外源質粒為pUC19和pAcHl中的至少一種。
[0019]優選的，所述外源基因的質粒為pUC19_^/力和pAcHl-hp倆種質粒的混合質粒；所述pUC19-#>含有綠色熒光蛋白報告基因g//基因，所述pAcHl-如洽有潮霉素抗性選擇基因如?基因。本領域人員應當理解，pUC19-力和pAcHl-AjOi只是可以用于本發明轉基因操作的質粒，并不是對本發明的適用范圍的限定。
[0020]本發明的有益效果
I)本發明轉基因操作過程耗時短，僅需不到10天； 2)本發明所得轉化率最高可達62.95%。
[0021]3)本發明無需復雜的操作，易于實施。
【附圖說明】
[0022]圖1為